ETUDE CINETIQUE DE LA TRYPSINE

I) But La finalité de ce TP est d’étudier les caractéristiques cinétiques d’une enzyme digestive des protéines, la trypsine. Pour cela, on chercher à déterminer la valeur de Vm, de KM ainsi que du kcat.

II) Principe Pour déterminer ces différents paramètres, nous allons faire deux expériences distinctes incluant un dosage spectrophotométrique : dans la première, nous allons faire varier la concentration en enzyme et, dans la seconde, la concentration en substrat.

* Action de la trypsine Pour comprendre le principe de ce TP, il est tout d’abord nécessaire d’appréhender son fonctionnement. C’est une enzyme qui contribue à la digestion des protéines alimentaires dans le pancréas en catalysant l’hydrolyse des liaisons peptidiques de 2 acides aminés : la lysine et de l’arginine. Elle agit également sur un substrat cinétique en clivant les liaisons du chlorhydrate de benzylocarbonylarginyl-para-nitroanilide qui libère un chromophore, la p-nitroaniline. Cette molécule peut être dosée spectrophotométriquement à 410 nm et son action étant intimement liée à celle de la trypsine, l’absorbance rend donc compte de l’activité enzymatique. Les différents paramètres cinétiques de notre enzyme sont reliés par l’équation de Michaelis-Menten : v=Vm×[S]KM+ [S]

* Dosage spectrophotométrique Le principe est de mesurer à l’aide le spectrophotomètre l’absorbance d’une solution pour une longueur d’onde donnée. Cette mesure est directement proportionnelle à la concentration du produit étudié. Or la concentration de ce produit est le fruit d’une activité enzymatique plus ou moins intense de la trypsine, c'est-à-dire de la production de la p-nitroaniline. La concentration en p-nitroaniline peut alors être déduite de l’absorbance par la loi de Beer Lambert où A est l’absorbance sans unité, ε est le coefficient d'extinction molaire spécifique d’une substance en L.mol-1.cm-1, l est la longueur de la cuve en cm et c, la