Compte rendu ceg

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  • Publié le : 13 novembre 2012
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Compte rendu TP de CEG

I -Activité transactivatrice de ER dans le système de levures transformées.

L’objectif de cette manipulation est d’étudier le mode d’activation en fonction de différents traitements hormonaux de la transcription du gène LacZ chez deux souches de levures, l’une possédant le récepteur à l’oestradiol humain (WT-1) et l’autre témoin (BJ-ECZ).

Fig1 : Etude del’activité β-galactosidase en fonction de différents traitements hormonaux à une concentration de 10-7M

Légende :

etOH1 : souche BJ-ECZ traitée à l’éthanol
etOH2 : souche WT-1 traitée à l’éthanol
E2 : souche WT-1 traitée à l’oestradiol
DEXA : souche WT-1 traitée à la dexaméthasone
P : souche WT-1 à la progestérone
DES : souche WT-1 au diéthylsillbestrol
Tx : souche WT-1 au 4-hydroxyTamoxifenE3 : souche WT-1 à l’estriol

L’activité β-galactosidase observée est le reflet de l’activité transcriptionelle.
Nous n’observons aucune activité β-galactosidase pour la souche BJ-ECZ traitée à l’éthanol. En effet cette souche de levure ne possède pas le récepteur à l’oestradiol humain (hER).
Il en est de même pour la souche WT-1 mais celle ci au contraire possède hER.
On peut en conclure quel’éthanol n’est pas un facteur de transcription efficace, ils peuvent être considérés comme des contrôles négatifs.

Concernant le traitement E2 nous observons une activité β-galactosidase importante de 0,139 U (unité de Miller). L’œstradiol a une forte affinité pour le recepteur hER, et induit ainsi une transcription.
Il en est de même pour le traitement au DES. On a une activité β-galactosidasede 0,156 U (unité de Miller). Le DES a une affinité pour hER et induit aussi une activité transcriptionelle. Le DES est un agoniste de l’œstradiol.
Pour E3 on observe une activité β-galactosidase deux fois moins importante qu’avec un traitement à l’œstradiol. E3 est un ligand ayant une affinité moindre pour le recepteur hER comparé à l’œstradiol.

Concernant les traitements aux DEXA, Tx, etP, on observe aucune activité β-galactosidase, donc pas d’activité transcriptionelle.

Cependant nos calculs des unités de Miller étaient basés sur les valeurs de DO à 420nm lors du dosage de l’activité β-galactosidase. Les valeurs concernant les traitements éthanol, Dexa, Tx et P étaient négatives. Ceci pouvant étre dû à des erreurs de manipulation. Toutefois, nous pouvons supposer qu’ilexiste une activité transcriptionelle basale.

Fig2 : activité β-galactosidase en unité de Miller en fonction de différentes concentrations en œstradiol (E2) et estriol (E3)

Légende :

E2 : souche WT-1 traitée à l’œstradiol
E3 : souche WT-1 traitée à l’estriol

Analyse du graphe :

Dans les deux graphes, nous observons une augmentation progressive de l’activité β-galactosidase, donctranscriptionnelle.

Concernant l’œstradiol, nous observons une très faible activité β-galactosidase avec de faibles concentrations (10-11 et 10-10M). Cependant, à partir d’une concentration de 10-9, nous constatons une forte augmentation de cette activité.

Concernant à présent l’estriol (E3), nous n’observons pas d’augmentation de l’activité β-galactosidase avant une concentration de…Ainsi, nous pouvons penser que le récepteur ou facteur de transcription hER est plus sensible à l’œstradiol qu’à l’estriol. Ceci pourrait expliquer l’activité β-galactosidase deux fois plus faible qu’en présence d’œstradiol que nous avons observée précédemment.

II- Le gel-retard

Le but de cette manipulation est de vérifier la spécificité d’interaction entre le domaine DBD du récepteur auxglucocorticoïdes de la truite arc-en-ciel à la séquence ADN GRE.

Fig.3 : Autoradiogramme obtenu par une expérience de gel-retard permettant d’étudier la spécificité de liaison du domaine DBD du récepteur des
glucocorticoïdes de la truite arc-en-ciel à la séquence ADN-GRE.

Légende :

Puits 1 : Sonde Biot-GRE 100ng
Puits 2 : Sonde Biot-GRE 100ng + 100ng de GST purifiée
Puits 3 : Sonde...
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