Titre :
Sous-Clonage d’un fragment d’ADN dans un vecteur bactérien
Matériel biologique :
Plasmide PSK
Plasmide PCR-gai
Enzymes de restriction :
EcoRI, HindIII, Xho Introduction :
Le clonage d'un gène est une grande technique en biologie moléculaire, c'est une opération consistant à isoler un gène, l'introduire dans un vecteur et à le reproduire en grande quantité. Parfois il est nécessaire d’effectuer un sous clonage permettant d’insérer dans un nouveau vecteur un fragment d'ADN de l’insert déjà cloné et isolé par ailleurs. Lors de notre TP nous avons sous-cloné à partir de pCR-gai la moitié 5’ du gène GAI (un gène d’Aradopsis thaliana code pour un facteur de transcription impliqué dans la voie de signalisation des hormones gibbérellines) dans le vecteur pSK afin de créer le nouveau plasmide pSK-gai 5’. Pour cela il nous faut des fragments linéaires et purs. Pour obtenir ces fragments nous avons commencés par la digestion des plasmides pSK et pCR-gai par deux même enzymes de restriction. Ensuite pour séparer les produits de digestion on fait une électrophorèse sur gel d’agarose, les inserts seront purifiés du gel par la suite, puis nous les avons quantifiés pour ajuster les conditions de la ligation, cette dernière se fait en présence d’enzyme de ligation pour ligaturer l’insert au vecteur,
On a fait la pré-culture et la culture de DH5alpha puis nous avons préparés les bactéries compétentes et nous sommes passé a la transformation et l’étalement des bactéries, et enfin nous avons fait l’analyse visuelle des clones bactériens obtenus (une analyse moléculaire par PCR sur colonies et une analyse moléculaire par