Hplc

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  • Publié le : 13 novembre 2011
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Détermination du site actif d’un peptide synthétique par HPLC :
IBut :

Ce TP va nous permettre de localiser la zone d’interaction d’un peptide synthétique avec l’héparine en analysant le peptide digéré ou non dans une colonne de HPLC puis en déterminant la capacité du peptide digéré avec l’héparine grâce à une chromatographie d’affinité.

II- Principes :
1) Chromatographie en phaseinversée avec appariement d’ions : Cette chromatographie a une phase stationnaire composé de Silice à laquelle on a greffé des groupements alkyles, ici, CH2(CH2)6- CH3 donc non polaire et la phase mobile est relativement
polaire. Par conséquent, plus les molécules seront apolaires, plus elles seront retenues. Dans cette technique, on apparie toujours des ions pour permettre de séparer des molécules troppeu soluble dans l’eau pour faire une chromatographie d’échange d’ions et trop ionisées pour réaliser une chromatographie d’adsorption ou de partage. On effectue ceci en ajoutant un ion compensateur, ici, l’acide trifluoroacétique (TFA) qui est chargé négativement et est hydrophobe. Il se lie donc aux ions de l’échantillon pour former une paire d’ions globalement neutre ce qui aide à lasolubilisation de peptides difficiles et permet de diminuer l’effet du caractère ionique de ces peptides sur leur séparation. SCHEMA

2) HPLC : La chromatographie liquide à haute pression est une méthode de séparation sur laquelle on peut appliquer les autres types de chromatographie comme l’adsorption, la polarité. La haute performance de cette technique n’est pas uniquement due à la pression mais aussigrâce à la qualité de la phase stationnaire qui peut contenir qu’un petit volume de produit à analyser et grâce à la finesse des particules.

III- Résultats et interprétations :
1) Conditions opératoires de l’HPLC : On applique un débit de 1mL/min, avec une phase mobile polaire contenant de l’eau de l’acétonitrile et du TFA. La phase stationnaire contenu dans la colonne est apolaire etconstitué de silice greffée avec de l’octylsilane. C’est un support de microparticules avec des pores de 300A pour que le peptide puisse rentrer dans le gel. On crée un gradient d’élution en diminuant le pourcentage de TFA 0.1% et en augmentant l’acétonitrile ce qui permet de rendre la phase mobile de plus en plus apolaire pour éluer les molécules qui sont retenues par la phase stationnaire. Ladétection se fait à 214nm ce qui est très bas dans l’UV et donc permet de tout détecter, c’est pour cela qu’on peut obtenir des pics fantômes. D’après le nombre d’acides aminés hydrophobes dans la séquence étudiée, on peut dire que le peptide injecté est polaire. Le volume d’injection pour le peptide non digéré est arbitraire et celui du peptide digéré est de 150µL mais les volumes sont dans tous les castrès faible, de plus quand on en injecte un peu trop, le surplus est éliminé par la boucle. 2) HPLC- injection témoin : D’après le chromatogramme (annexe 1), on remarque qu’il n’y a pas de pics fantômes mais qu’il y a bien le pic d’injection à 0.750 minutes. On constate que la courbe à une faible pente qui augmente au fur et à mesure que le solvant B augmente au cours du temps et qui sera présentedans tous les autres chromatogrammes. 3) HPLC de la séquence C terminal du collagène XIV non digéré : Sur le chromatogramme en annexe 2, on observe deux pics : celui d’injection à Tr= 0.920 minutes et celui du peptide à Tr= 9.520 minutes. Cette HPLC nous permet de connaitre le temps de rétention (Tr) du peptide non digéré pour pouvoir le comparer aux autres chromatogrammes. 4) HPLC de la séquenceC terminal du collagène XIV digéré : Annexe 3 D’après notre séquence : Ala-Val-Glu-Leu-Arg-Ser-Pro-Gly-Ile-Ser-Arg-Phe-Arg-Arg-Lys-Ile-Ala-Lys-Arg-Ser-IleLys-Thr-Leu-Glu-His-Lys-Arg-Glu-Asp-Ala-Lys-Glu, on constate qu’il y a plus d’acides aminés polaires (en bleu) que hydrophobes (en rouge) donc notre peptide est polaire. On a un pic à 9,58 minutes ce qui correspond au temps de rétention du...
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