Détermination du site actif d’un peptide synthétique par HPLC :
IBut :

Ce TP va nous permettre de localiser la zone d’interaction d’un peptide synthétique avec l’héparine en analysant le peptide digéré ou non dans une colonne de HPLC puis en déterminant la capacité du peptide digéré avec l’héparine grâce à une chromatographie d’affinité.

II- Principes :
1) Chromatographie en phase inversée avec appariement d’ions : Cette chromatographie a une phase stationnaire composé de Silice à laquelle on a greffé des groupements alkyles, ici, CH2(CH2)6- CH3 donc non polaire et la phase mobile est relativement polaire. Par conséquent, plus les molécules seront apolaires, plus elles seront retenues. Dans cette technique, on apparie toujours des ions pour permettre de séparer des molécules trop peu soluble dans l’eau pour faire une chromatographie d’échange d’ions et trop ionisées pour réaliser une chromatographie d’adsorption ou de partage. On effectue ceci en ajoutant un ion compensateur, ici, l’acide trifluoroacétique (TFA) qui est chargé négativement et est hydrophobe. Il se lie donc aux ions de l’échantillon pour former une paire d’ions globalement neutre ce qui aide à la solubilisation de peptides difficiles et permet de diminuer l’effet du caractère ionique de ces peptides sur leur séparation. SCHEMA

2) HPLC : La chromatographie liquide à haute pression est une méthode de séparation sur laquelle on peut appliquer les autres types de chromatographie comme l’adsorption, la polarité. La haute performance de cette technique n’est pas uniquement due à la pression mais aussi grâce à la qualité de la phase stationnaire qui peut contenir qu’un petit volume de produit à analyser et grâce à la finesse des particules.

III- Résultats et interprétations :
1) Conditions opératoires de l’HPLC : On applique un débit de 1mL/min, avec une phase mobile polaire contenant de l’eau de l’acétonitrile et du TFA. La phase stationnaire contenu dans la colonne est apolaire et