Les outils de génétique moléculaire
Les techniques liées aux acides nucléiques
Détection, caractérisation et identification des acides nucléiques

Marquage et suivi des acides nucléiques
Le marquage est principalement employé dans toutes les techniques qui utilisent une sonde (hybridation, Northern, …..). On distingue le marquage dit 'chaud' utilisant des isotopes radioactifs, et les marquages 'froids' qui utilisent des molécules aux propriétés fluorescentes, luminescentes. Ces dernières sont de plus en plus employées car plus pratiques.

Marquage radio-actif (1/2)

On distingue plusieurs méthodes selon la localisation du marquage (extrémités ou interne à la molécule) et selon la nature de la séquence marquée (simple ou double brin).
Le Phosphore 32 est le radioisotope le plus utilisé. Incorporé dans la sonde enzymatiquement au moyen d'un ou plusieurs nucléotides triP radiomarqués Il existe des sondes mono ou double brins Soufre 35, H 3 utilisés plutôt pour le séquençage et hybridation in situ. On peut aussi réaliser un marquage en 5' : avec la T4 polynucléotide kinase. La radioactivité est aussi utile pour le marquage des oligonucléotides de synthèse.

Les sondes double brins

Marquage par amorçage au hasard (Random Printing) :
Très employé dans les laboratoires pour par exemple les Southern et Northern Blot, il permet d'obtenir des activités spécifiques plus élevées, nécessaires pour détecter un gène sur quelques mG d'ADN génomique. Dans cette technique de marquage, les deux brins d'ADN de la sonde sont préalablement séparés par chauffage suivi d'un refroidissement brutal. Puis, on ajoute un mélange d'oligonucléotides (hexanucléotides) de synthèse correspondant à toutes les combinaisons mathématiquement possibles (soit 46 = 4096 nucléotides). Ces oligonucléotides vont s'hybrider avec le sonde pour une partie d'entre eux. Ces oligonucléotides fixés vont servir d'amorces au fragment de Klenow de l'ADN polymérase I qui va reconstituer