Etude cinétique de la trypsine

I. But
Le but de ce TP est de déterminer les paramètres cinétiques de la trypsine : * Le KM qui correspond à la constante de Michaelis ; * La Vmax qui correspond à la vitesse maximale et ; * v, la vitesse initiale.

II. Principe
La trypsine est une enzyme digestive du suc pancréatique qui a pour but de digérer les protéines. La trypsine est une endoprotéase qui hydrolyse les liaisons peptidiques dans lesquelles un acide aminé basique, la lysine ou l’arginine engage sa fonction acide. Elle coupe en C-terminal de ces acides aminés.
Nous pouvons étudier ces paramètres cinétiques à partir d’un substrat synthétique : le chlorhydrate de benzyloxycarbonylarginyl-para-nitroanilide (Z-Arg-p-NA, HCL).
L’hydrolyse de ce substrat par la trypsine libère un produit chromophore la p-nitroaniline. Celui-ci peut être dosé spectrophotométriquement à 420 nm.
Grace à cette propriété, nous allons pouvoir mesurer la variation de l’absorbance en fonction du temps. L’absorbance au cours du temps va augmenter ca nous suivons la vitesse d’apparition du produit. A partir des résultats nous pourrons connaître l’activité enzymatique de la trypsine et en déduire ces paramètres cinétiques (KM , Vm et v) grâce à l’équation de Michaelis-Menten :

v = Vm × SKM + S v=vitesse initiales
Vm =vitesse maximale
KM =constante de Michaelis

III. Résultats et interprétation

1. Réaction d’hydrolyse du substrat par la trypsine

2. Choix de la longueur d’onde
Le pic d’absorbance du produit est à 380nm. Cependant, à cette longueur d’onde le substrat absorbe toujours, alors que nous désirons doser spectrophotométriquement que le produit.
A partir de 410nm, le substrat n’absorbe plus tandis que le produit absorbe toujours suffisamment.
C’est pour cela que l’on choisit λ = 410nm.

3. Définitions

* Une enzyme est un biocatalyseur, agissant à des concentrations très faibles, capable de multiplier la vitesse