ENZYMOLOGIE EN PHASE HOMOGENE:
ETUDE DE LA PHOSPHATASE ALCALINE

Les phosphatases ou phosphomonoestérases sont des enzymes qui hydrolysent les monoesters phosphoriques avec formation de phosphate minéral et d'un alcool ou d'un phénol, selon la réaction:

R-O-PO32- + → R-OH +

HPO42-

METHODOLOGIE
La manipulation permet l'étude de l'influence de plusieurs facteurs sur la réaction enzymatique. L'enzyme utilisée est une préparation commerciale partiellement purifiée de phosphatase intestinale de veau, la réaction sera suivie en dosant les produits apparus dans le milieu lorsque l'enzyme est mise en présence du substrat. Pour des raisons de commodité, ce dernier est le para-nitrophényl phosphate (pNPP), composé incolore qui libère par hydrolyse en milieu alcalin du p-nitrophénolate (pNP) jaune et dosable directement par spectrophotométrie à 410nm.

pNPP incolore

pNP jaune
(dosable à max= 410nm)

La densité optique de la solution à 410 nm est proportionnelle à la production de pNP, une gamme étalon établie à partir de concentrations (ou quantités) connues de pNP permettra donc de connaître la correspondance entre la concentration (ou quantité) de pNP et la DO et donc de déduire de la DO lue la concentration (ou quantité) de pNP apparue dans le milieu réactionnel. Dans le cas d'essais enzymatiques, un blanc devra être réalisé en remplaçant l'enzyme par un volume d'eau équivalent afin de tenir compte de l'hydrolyse spontanée du pNPP. L'utilisation d'un substrat chromogène tel que le pNPP permet d'éliminer le recours à une réaction auxiliaire pour doser les produits formés, ce qui serait le cas si on voulait suivre par exemple la libération de phosphate minéral dans le milieu.
MATERIEL ET PRODUITS
Matériel
- Bain thermostaté à 37°C
- Chronomètre
- Spectrophotomètre à 410 nm
- Agitateur Vortex pour tubes à essai
- 40 tubes à essai
- 1 portoir de 24 tubes
- 1 portoir de 12tubes

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Produits
- Na2HPO4 0,5M
- Tampon Tris-HCl 0,1 M pH 8,3
-p-nitrophényl phosphate (pNPP)