Chapitre 3 : Transformation des bactéries avec l’ADN plasmide, purification et caractérisation de l’ADN plasmide
Transformation des bactéries par l’ADN plasmide et purification de l’ADN plasmide
Matériaux :
1 aliquot de 15µL d’ADN plasmide stérile (pGFP-actin à 12ng/µL)
200mL de milieu LB stérile à température ambiante (dans un erlenmeyer couvert de papier d’aluminium)
3 pétris gélose LB-ampicilline (50µg/mL)
1 pétri gélose LB
50mL de CaCl2 à 100mM, 4°C
Solution saturée de bactéries DH5alpha préparée d’avance par l’instructeur
Tampons P1, P2, N3, PB, PE
Tampon d’élution TE (10mM Tris – 1mM EDTA) ddH2O Éthanol
Culture de bactéries transformées avec pGFP-actin
Pipettes pasteur 9 pouces pour patin
Tubes eppendorf stériles et support
Colonnes minipreps Qiagen
Briquet
Seau et glace
Instruments :
Incubateur agitateur
Spectrophotomètre UV-VIS Ultrospec 1100 pro GBM-3610-027 et cuvettes plastiques
Bain-marie à 42°C
Microcentrifugeuse
Bec Bunsen
Micropipettes Gilson p20, p200 et p1000
Agitateur vortex
Boucle d’inoculation fabriquée à partir d’une pipette pasteur de 9 pouces
Lecteur de microplaques avec accessoire Take 3
Méthodes
Pour ce laboratoire, nous avons suivi les protocoles listés ci-dessous, tirés du recueil de laboratoire. Les modifications appliquées seront indiquées.
SOP – CELL-1 : Préparation des bactéries compétentes
On a laissé incuber les bactéries dans le milieu LB pour une heure seulement au lieu d’une heure et demi. Après avoir transféré les bactéries dans un tube de 50mL, le surnageant obtenu après chaque étape de centrifugation a été délicatement versé et non pipeté, sur les conseils de l’instructeur. Le reste du protocole a été respecté.
SOP – BIO-2 : Miniprep purification de l’ADN plasmide à partir des bactéries transformées
Aucune modification apportée au protocole.
SOP EQP-4.2 : Lecteur de Microplaques avec TAKE3 pour le dosage d’ADN
Aucune modification apportée au protocole.
Cartes de restriction d’ADN et