BELVAL Hélène COLAS Boris

Caractérisation moléculaire et biochimique de l’oxalate oxydase
Introduction :
L’oxalate oxydase est une enzyme présente dans de nombreux végétaux dans la paroi cellulaire de différents organes. Sa présence est souvent liée aux réponses à différents stress extérieurs. Elle permet la production du péroxyde d’hydrogène ( H2O2) composé toxique au fort pouvoir oxydant qui va être par la suite utilisé pour des réactions de réticulation au sein de la paroi ou dans la transduction de signaux. Réaction : OxO (COOH)2+O2 ====> CO2+H2O2 Dans la première partie de ce TP, nous allons d’abord mettre en évidence la présence du gène de cette enzyme chez le blé avec la réaction de PCR, en testant 4 méthodes d’extractions et lors de la seconde partie, nous utiliserons 2 méthodes différentes pour caractériser l’activité enzymatique (localisation de l'activité et importance de l'activité selon les conditions de stress) après culture des plantes lors de différentes conditions de stress abiotiques.

Premiere Partie : Mise en évidence chez le Blé du gène de l’Oxo.
I] Matériel et Méthodes A) Matériel Végétal Le matériel végétal utilisé sera le Blé ( Triticum aestivum ) de la famille des Poacées. Mis en germination sur la perlite imbibée d’eau distillée. Après 96 H, les plants sont mis dans différentes conditions expérimentales : sur une solution témoin (H2O) et sur d’autre solutions contenant des métaux : CuCl2, CdSO4, NiCl2, MnCl2. Dans notre cas, nous nous occuperons des plants contenant les solutions de NiCl2 et MnCl2. B) Méthodes 1)Extraction d’ADN (génomique) En général pour extraire :On commence en général par une lyse des cellules ou des tissus, consistant éventuellement en un broyage, suivi d'une extraction par des détergents, qui vont disperser les bicouches lipidiques des membranes et dénaturer les protéines, et en particulier celles qui sont associées à l'ADN dans la chromatine. La solution obtenue est en général très visqueuse, car l'ADN ainsi