Tp phosphatase alcaline

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I. Introduction



Le but de cette manipulation est de déterminer les paramètres cinétiques d’une enzyme afin
d’étudier l’influence de la concentration en substrat et de la présence d’un inhibiteur sur la
vitesse de réaction.

Dans ce TP, nous allons utiliser une préparation commerciale de phosphatase alcaline de
veau. Il s’agit d’une enzyme alcaline à 2 substrats, capabled’hydrolyser les monoesters
phosphoriques selon la réaction suivante :



R-O-PO3 2- + H2O R-OH + HPO4 2-



II. Principe



Afin de suivre la réaction enzymatique, nous allons réaliser un dosage spectrophotométrique
des produits apparus dans le milieu, lorsque l’enzyme est en présence de son substrat. Pour
faciliter le dosage, nous allons utiliser comme substrat leP-nitrophénolphosphate (PNPP)
qui, après action de l’enzyme, libère un produit coloré (jaune) : le P-nitrophénol (PNP)
directement dosable à 410nm.



+ H2O HPO42- +



PNPP incolore PNP coloré



Le principe du dosage spectrophotométrique est de mesurer l’absorbance d’une substance
colorée, au cours du temps. Le spectrophotomètre est relié à un dispositif d’enregistrement
(ordinateur),qui nous permet de visualiser l’évolution de l’absorbance dans un intervalle de
temps (3min), et donc de déterminer la vitesse initiale de la réaction enzymatique grâce à la
pente de la droite obtenue, dans les temps initiaux (.DO/min).

De plus, pour connaître la quantité de produit apparu dans le milieu, on réalise une gamme
étalon de tubes contenant différente concentration (connues)de produit. On trace la droite


2FigPart2
DO = f ([PNP]). En reportant l’absorbance d’une solution de concentration inconnue, on
peut en déduire sa concentration.















III. Manipulations préliminaires



Afin de réaliser la gamme étalon et les milieux d’incubation, nous devons préalablement
préparer les solutions de substrats de concentrationsdifférentes.



1) Solution de PNPP :

Nous voulons préparer 6 tubes de solution de PNPP à 2,5 mM, 1mM, 0,5mM, 0,25mM,
0,167mM, 0,125mM, à partir d’une solution mère de 5mM. Pour cela, nous effectuons une
dilution en cascade.



10mL 8mL 10mL 10mL 13,4mL 5mL











5mM 2,5 mM 1mM 0,5mM 0,25mM 0,167mM 0,125mM




[PNPP]
(umol /L)

5mM

2,5mM1mM

0,5mM

0,25mM

0,167mM

0,125mM

Solution
mère
(mL)

20

10

8

10

10

13,4

5

H20 (mL)

0

10

12

10

10

6,6

15





Calcul pour la première dilution :

C1 V1 = C2 V2

V1 = 20mL

Donc V1 = (C2 V2 )/ C1 V = (0,0025 * 0,02) / 0,005 = 10 mL

Il faut donc prélever 10mL de la solution mère, et ajouter10mL d’eau pour la diluer 2 fois.



2) Solution de glycérophosphate :

Comme précédemment, nous voulons préparer 2 tubes de solution de glycérophosphate à
2,5mM et 1mM, à partir d’une solution mère à 5mM.





7mL 4mL









5mM 2,5 mM 1mM



[GRO-P]

5mM

2,5mM

1mM

Solution mère (mL)

10

7

4

H20 (mL)

0

7

6
Calcul pour la première dilution :

C 1 V1 = C2V2

Vf1 = 10mL

Donc V1 = ( C2 V2)/ C1 V = (0,0025 * 0,0014) / 0,005 = 7 mL

Il faut donc prélever 7mL de la solution mère et ajouter 7mL d’eau pour la diluer 2 fois.

IV. Etude cinétique de la libération du produit



1) Gamme étalon n°1 :

Nous préparons la gamme étalon puis nous mesurons la DO dans chaque tube à410 nm,
longueur d’onde à laquelle le produit (PNP) absorbe. Nous traçons, ensuite, la droite étalon :
DO corrigée = f (quantité de PNP)

CF tableau 1 et figure 1a

Calcul de la quantité de produit dans les tubes :

n = CV

Tube 1: n = 0 µmole

Tube 2: n= (0,5.10-3. 0,025.10-3)= 0,0125 µmole (C= 6, 25 µmole/ L)

Tube 3: n= (0,5.10-3. 0,05.10-3) = 0,025 µmole (C=12,5...
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