Électrophorèse de protéines et immuno-révélation

Pages: 13 (3210 mots) Publié le: 13 novembre 2012
Électrophorèse de protéines et immuno-révélation

But

Le but du TP est de vérifier la pureté du lysozyme purifié à partir de blanc d’œuf par chromatographie. Pour cela, deux techniques d’électrophorèse ont été utilisées : SDS-PAGE et Western Blot

Principe

Au cours de ce TP, nous avons utilisé plusieurs méthodes d’analyse de la pureté d’une fraction.

Électrophorèse :Généralités
L’électrophorèse est une technique analytique basée sur le déplacement de particules chargées dans un champ électrique généré par un courant électrique. Les particules chargées négativement migrent vers l’anode et les particules chargées positivement migrent vers la cathode.
Dans notre cas, la migration a été réalisée sur gel de polyacrylamide. Ce gel est une structure semi-solide issue de lapolymérisation entre de l’acrylamide et du bis-acrylamide, qui forment un réseau. Il est composé de deux gels :
Un gel de concentration : les dépôts seront tout d’abord en contact avec ce gel, qui a pour but de concentrer les échantillons en une bande fine avant d’arriver au second gel, afin d’éviter un décalage de migration.
Un gel de résolution : il a cette fois un rôle de tamis pourséparer les molécules lors de la migration. La concentration en acrylamide peut être modifiée (dans notre cas nous avons utilisé à gel à 10% et un gel à 15%), ce qui modifiera le pouvoir résolutif ou domaine de fractionnement des gels. Ainsi, plus un gel est concentré en polyacrylamide, plus il retient les molécules et ralenti la migration. Un gel peu concentré en polyacrylamide aura des mailles plusimportantes et retiendra moins les petites molécules.
La migration d’enzymes marqueurs permet de tracer une courbe de calibration, qui permet de déterminer la masse moléculaire d’une protéine inconnue, si celle-ci entre dans le domaine de fractionnement (zone linéaire de la courbe) :

Log (masse moléculaire) = f (distance de migration)

Électrophorèse SDS-PAGE
L’électrophorèse a été réalisée encondition dénaturante, c’est-à-dire en présence de sodium dodecyl sulfate (SDS). Le SDS est une molécule chargée négativement qui va envelopper les chaînes peptidiques et les charger négativement : ainsi, toutes les protéines seront sous forme de macropolyanions et migreront dans le même sens, vers l’anode.
La migration a été réalisée dans deux conditions différentes : en présence et en absencede β mercaptoéthanol. Il s’agit d’un agent réducteur qui réduit les ponts disulfure et qui permet, par comparaison des marqueurs en sa présence et son absence, d’avoir une idée de leur structure (plusieurs sous unités liées par des ponts disulfure inter-chaîne, une sous unité enroulée grâce à un pont disulfure intra-chaîne).
Le chauffage lors de la migration permet de dérouler les protéines afinde les séparer les protéines uniquement en fonction de leur taille en présence de β mercaptoéthanol.
Une coloration au bleu de coomassie est alors réalisée. Cette coloration révèle toutes les protéines présentes à la surface du gel, elle n’est donc pas spécifique, et permet de mesurer la distance de migration de chacune d’elles afin de déterminer le domaine de fractionnement.

Western Blot :électro-transfert et immuno-révélation
Le Western Blot se déroule en plusieurs étapes.
Tout d’abord une électrophorèse en gel de polyacrylamide comme décrite ci-dessus.
Electro-transfert

Une fois la migration terminée, l’électro transfert est réalisé. En effet, les protéines ont migré sur le gel de polyacrylamide mais celui-ci ne peut pas être utilisé pour la révélation. Il faut donctransférer les protéines du gel vers une membrane de nitrocellulose.
Pour cela, la face du gel sur laquelle sont les protéines et la membrane sont placés l’un contre l’autre en sandwich entre des papiers Wattman et des éponge. Le tout est placé à migrer dans une nouvelle cuve, avec l’anode côté membrane de nitrocellulose et la cathode côté gel.
Les protéines, chargées négativement grâce au SDS,...
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