FREJEBISE CEDRIC MONTGAILLARD GILLES

ETUDE DE LA CARBOXYFLUORESCEINE PAR FLUORESCENCE

IUP BIO BBM13 Option 1 1999-2000 Introduction

LA CARBOXYFLUORESCÉINE EST UN MARQUEUR EXTRINSÈQUE, C’EST-À-DIRE QU’ELLE N’EST PAS PRÉSENTE NATURELLEMENT DANS LE MILIEU BIOLOGIQUE (MEMBRANES, CELLULES...). ELLE EST TRÈS UTILISÉE EN BIOCHIMIE, BIOPHYSIQUE ET BIOLOGIE CELLULAIRE COMME MARQUEUR EXTRINSÈQUE DANS BON NOMBRE D’EXPÉRIMENTATIONS EN BIOLOGIE NOTAMMENT POUR MARQUER ET TRACER DES MOLÉCULES QUI N’ABSORBENT PAS. CAR IL POSSÈDE UN HAUT RENDEMENT DE FLUORESCENCE DANS LE VISIBLE.

But

AU COURS DE CE TP , NOUS ALLONS DANS UN PREMIER TEMPS, CARACTÉRISER CE FLUOROPHORE D’UN POINT DE VUE SPECTRAL, PAR SA LONGUEUR D’ONDE MAXIMUM D’ABSORPTION ET PAR SA LONGUEUR D’ONDE MAXIMUM D’EXCITATION. DANS UN SECOND TEMPS, NOUS ÉTUDIERONS LES EFFETS DES DIFFÉRENTS PARAMÈTRES PHYSICO-CHIMIQUES SUR L’INTENSITÉ DE FLUORESCENCE DU FLUOROPHORE TELS QUE LA PRÉSENCE OU L’ABSENCE D’O2, L’EFFET DU PH, L’EFFET DE LA CONCENTRATION. ENFIN, NOUS ÉTUDIERONS LE QUENCHING DE FLUORESCENCE DE LA CARBOXYFLUORESCÉINE PAR L’IODURE DE POTASSIUM KI.

A. Caractérisation spectrale de la carboxyfluorescéine

1. ETUDE DU SPECTRE D’ABSORPTION

On réalise dans un premier temps un spectre d’absorption afin de déterminer le [pic]max d’absorption. Nous mesurons grâce à un spectrophotomètre la DO d’une solution de 10 [pic]M de carboxyfluorescéine de 450 à 510 nm (de 5 en 5nm). On trace ainsi le spectre d’absorption de la carboxyfluorescéine.

➢ Principe

TOUT D’ABORD, NOUS ALLONS ÉTUDIER DU POINT DE VUE SPECTRAL LA CARBOXYFLUORESCENCÉINE ; POUR CELA, NOUS UTILISONS UNE SOLUTION MÈRE DE CF À 2MM DILUÉE DANS 20ML DE VOLUME TOTAL POUR OBTENIR UNE