Protocole

Pages: 4 (798 mots) Publié le: 30 mai 2012
Lycée J.Moulin Pézenas – janvier 2003 Atelier scientifique OGM

D’après Biotechnology explorer – pGLO bacterial transformation kit

Protocole de transformation bactérienne
La souche bactérienneE.coli HB101 a été sélectionnée en vue d’une transformation efficace et sécurisée : naturellement non pathogène, sa résistance aux défenses immunitaires humaines ont été encore diminuées sescomposants de surface et son équipement enzymatique favorisent l’adhésion, la conservation et l’expression du plasmide dépourvue de plasmides naturels, elle ne peut pas, non plus, après transformation,échanger le plasmide avec d’autres bactéries, ses besoins nutritifs stricts l’empêchent de se développer hors de son milieu de culture au laboratoire, Expliquer l’intérêt des particularités de la souchebactérienne choisie … La culture de départ a été ensemencée la veille et incubée une nuit à 37°C. Les bacté ries de cette culture sont en phase de division, ce qui les rend particulièrement aptes à intégrerun plasmide : elles sont qualifiées de « compétentes ». Noter l’aspect des colonies bactériennes de cette culture de départ …

Dans un tube de transformation, marqué +pGLO, le plasmide va être misau contact de la suspension bactérienne. Un tube de contrôle, marqué –pGLO, où les bactéries ne seront pas transformées, sera utilisé, tout au long du protocole, comme témoin négatif.

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Lesgènes insérés sur le plasmide sont : Amp : résistance à un antibiotique, l’ampicilline GFP : synthèse d’une protéine fluorescente, la GFP araC : active, en présence d’arabinose dans le milieu, latranscription du gène GFP 1. Marquer 2 micro-tubes +pGLO et –pGLO, les fermer et les placer sur un portoir flottant. 2. A l’aide d’une micro-pipette à embout stérile, transférer 250 µl du tampon detransformation (tubeTT de CaCl2) dans chaque micro-tube. 3. Placer les tubes sur leur portoir dans de la glace pilée. 4. A l’aide d’un anse stérile, prélever une colonie bactérienne isolée dans la...
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