TP invertase

Pages: 9 (2196 mots) Publié le: 14 septembre 2014















Au cours de cette séance, Votre professeur appréciera les qualités d'organisation, la précision des gestes techniques, le respect des règles d'hygiène et de sécurité en laboratoire et l’utilisation du cahier du laboratoire.

1. Introduction

1.1 La réaction catalysée


La  fructosidase ou invertase ou saccharase de levure (D fructofurannosidefructohydrolase, EC 3.2.1.26) catalyse l'hydrolyse de la liaison osidique du saccharose.

Equation :
Saccharose + eau à D-glucose + D-fructose.



= Sucre inverti

A savoir : Le glucose et le fructose sont des glucides réducteurs, mais quand ils sont liés comme c’est le cas dans le saccharose ils perdent leur pourvoir réducteur (la fonction réductrice étant impliquée dans la liaisonosidique). Le mélange équimolaire de glucose et fructose issu de l’hydrolyse du saccharose correspond à du sucre inverti car il y a aussi inversion du pouvoir rotatoire.

L’avancement de la réaction n’est pas suivi en continu. Après arrêt de la réaction, le sucre inverti formé sera dosé par la méthode colorimétriques au 3.5 acide dinitrosalicylique (3.5DNS). L’alcalinité du réactif 3.5DNS et chauffagedénaturent l’enzyme et arrêtent la réaction.
1.2 Les caractéristiques de l’enzyme

Elle est localisée dans la paroi de la levure (  fructosidase externe ou exocellulaire) et dans la vacuole ( fructosidase interne ou endocellulaire ) . La  fructosidase interne ne représente qu’un faible pourcentage de l’invertase totale. La  fructosidase a un KM de l’ordre de 25 mmol/L, une masse molaired’environ 270 KDa ( 50 % de protéines et 50 % de mannane). Son pH optimum est compris entre 3.5 et 5.5. Son site de fixation comprend un groupement COO- nécessaire à la liaison du substrat. Son site catalytique contient un noyau imidazole nécessaire à la rupture de la liaison.

1.3 Le but de la manipulation
Le but est :
d’extraire et de purifier l’enzyme à partir de la levure.
de déterminer lavitesse initiale (Vi) de la réaction catalysée
de déterminer les constantes cinétiques (KM et Vmax) de l’enzyme en l’absence et en présence d’un effecteur chimique.
de déterminer l’influence de la concentration en enzyme sur Vi.
2. Conditions matérielles

En plus du matériel courant du laboratoire, vous disposez :

2.1 Réactifs et solutions.


Tampon acétate pH 4.7 à 0.1 mol.L-1 5 mLAgNO3 à 2 10-5 mol.L-1 dans Tp éthanoate pH 4.7 1 mL
Sucre inverti 5 mmol/L 5 mL
Saccharose 360 mmol/L 20 mL
3.5DNS en flacons individuels ( Xn, C ) 10 mL
 fructosidase non diluée 0.5 mL
Glace pour conservation de la  fructosidase

2.2 Matériel
Cuves au choix
Chronomètre
Bain-marie bouillant
Coton cardé, Papier d’aluminium, Parafilm
Lunettes de sécurité
VortexSpectrophotomètre + imprimante
Bain-marie + thermomètre




3. Manipulation
3.1- Préparation des deux extraits de l’invertase

Les parties 3.1.1 et 3.1.2 ont déjà été réalisées, le protocole ci-dessous n’est là que pour information.


3.1.1 Préparation de l’homogénat

- Broyer 25 g de levure au mixeur pendant 2 min dans 50 mL de tampon hydrogénocarbonate de sodium à0,1 moL/L.
- Noter le volume VH de l’homogénat obtenu.
- Répartir en fractions de 1 mL dans des Eppendorf.
- Congeler
3.1.2 Préparation de l’autolysat

Parallèlement sur un deuxième homogénat obtenu dans les mêmes conditions, réaliser les opérations suivantes:
- Transvaser la totalité du volume VH dans une fiole conique.
- Boucher au coton cardé.
- Incuber pendant 24 h au bainthermostaté à 40 °C.
- Centrifuger 15 min à 4000 tours I min.
- Récupérer le surnagent (autolysat) et noter le volume VA obtenu.
- Répartir en Eppendorf de I mL.
- Conserver une fraction dans la glace pour la détermination de la vitesse initiale de la réaction.
- Congeler les autres Eppendorf.

3-2 Gamme d’étalonnage du sucre inverti par le 3,5DNS.

But : Déterminer le coefficient...
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