Tp lysozyme

Pages: 8 (1857 mots) Publié le: 28 mai 2013
Le lysozyme : purification et mise en évidence dans le blanc d’œuf


A) Introduction :

Le lysozyme est une protéine enzymatique découverte par FLEMMING en 1922 et est présente dans la plupart des liquides organiques (sérum, larmes, salive, etc…). Elle hydrolyse les liaisons glycosidiques β (1-4) entre l’acide N acétyl muraminique (NAM) et la N acétyl glucosamine (NAG), principauxconstituants de la paroi bactérienne.

Nous nous proposons de purifier du lysozyme présent dans le blanc d’œuf grâce à une technique de chromatographie sur colonne de carboxyméthyl cellulose, échangeuse de cations ; puis de déterminer la présence de lysozyme par un test enzymatique et enfin, sa pureté, grâce à une électrophorèse.


Matériel et méthode

1) Purification dulysozyme

On récupère le lysozyme dans le blanc d’œuf (car il n’est pas présent dans le jaune d’œuf) par filtration sur gaze, puis sur papier filtre. Le filtrat obtenu constitue la fraction F0.

Pour la séparation, on utilise une colonne échangeuse de cations (anionique) : la carboxyméthyl cellulose, tamponnée à pH 10 par un tampon Glycine NaOH à 0,1M, car le lysozyme (pHi=11) a une chargeglobale positive (Lys+) alors que les autres protéines ont une charge globale nulle ou négative à un tel pH : Les molécules chargées positivement vont donc se fixer sur les billes de gel constituant la colonne, tandis que les autres constituants seront élués, on récupère ainsi la fraction F1 à la sortie de la colonne.

Remarque : il faut une hauteur de résine suffisante pour permettre unebonne séparation.




On lave la colonne avec un tampon Glycine et on récupère la fraction F2 (la charge globale des molécules fixées reste inchangée).

On procède à l’élution des protéines fixées à la colonne par ajout de tampon Glycine Sodium (Glycine NaOH( 0,1 M) + NaCl (0,5M) tamponné à pH 10). Ce tampon contient donc Na+ et Cl- en fortes concentrations par rapport au lysozyme. Na+va donc entrer en compétition avec les protéines fixées, et les remplacer sur la colonne. Les molécules sont décrochées et vont donc se retrouver dans les fractions suivantes (F3 et F4).

On met ensuite en évidence la présence de lysozyme par détection de son activité enzymatique.

2) Test d’activité enzymatique

Le « substrat » utilisé est composé de bactéries Micrococcuslysodeikticus, car on a vu que le lysozyme rompait la liaison β(1-4) entre NAM et NAG de la paroi bactérienne, dégradant ainsi la bactérie.

On peut suivre l’activité enzymatique du lysozyme en regardant l’absorbance à 450 nm après 3 minutes de réaction (le temps au lysozyme d’agir, t0 étant le temps de dépôt du lysozyme dans la cuve). En effet, les bactéries intactes forment une suspensionhomogène qui absorbe à 450 nm, tandis qu’une solution contenant les bactéries détruites absorbe moins, à la même longueur d’onde.

3) Electrophorèse en gel dénaturant

On veut séparer les protéines selon leur charge à un pH donné dans un champ électrique. Les protéines y seront séparées selon leur charge, leur masse et leur forme.

On utilise un gel de polyacrylamide avec undétergent anionique : le SDS (Dodécyl Sulfate de Sodium). Ce dernier entoure les molécules que l’on veut séparer et donne à toutes les molécules la même forme et la même charge ; la séparation se fera donc selon le Poids Moléculaire uniquement. Les molécules de petit PM migreront plus loin que celles de PM plus grand.

L’autre intérêt du SDS est qu’il linéarise les protéines : il détruit lastructure quaternaire en séparant les différentes sous unités.

On utilise également du β-mercaptoéthanol qui a pour rôle de détruire les ponts disulfures S-S. On obtient ainsi la structure primaire des protéines.

La structure tridimensionnelle des protéines étant détruite, on parle donc d’électrophorèse en gel dénaturant.

Le gel utilisé n’est pas uniforme, il se présente en 2...
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