Le lysozyme : purification et mise en évidence dans le blanc d’œuf

A) Introduction :

Le lysozyme est une protéine enzymatique découverte par FLEMMING en 1922 et est présente dans la plupart des liquides organiques (sérum, larmes, salive, etc…). Elle hydrolyse les liaisons glycosidiques β (1-4) entre l’acide N acétyl muraminique (NAM) et la N acétyl glucosamine (NAG), principaux constituants de la paroi bactérienne.

Nous nous proposons de purifier du lysozyme présent dans le blanc d’œuf grâce à une technique de chromatographie sur colonne de carboxyméthyl cellulose, échangeuse de cations ; puis de déterminer la présence de lysozyme par un test enzymatique et enfin, sa pureté, grâce à une électrophorèse.

Matériel et méthode

1) Purification du lysozyme

On récupère le lysozyme dans le blanc d’œuf (car il n’est pas présent dans le jaune d’œuf) par filtration sur gaze, puis sur papier filtre. Le filtrat obtenu constitue la fraction F0.

Pour la séparation, on utilise une colonne échangeuse de cations (anionique) : la carboxyméthyl cellulose, tamponnée à pH 10 par un tampon Glycine NaOH à 0,1M, car le lysozyme (pHi=11) a une charge globale positive (Lys+) alors que les autres protéines ont une charge globale nulle ou négative à un tel pH : Les molécules chargées positivement vont donc se fixer sur les billes de gel constituant la colonne, tandis que les autres constituants seront élués, on récupère ainsi la fraction F1 à la sortie de la colonne.

Remarque : il faut une hauteur de résine suffisante pour permettre une bonne séparation.

On lave la colonne avec un tampon Glycine et on récupère la fraction F2 (la charge globale des molécules fixées reste inchangée).

On procède à l’élution des protéines fixées à la colonne par ajout de tampon Glycine Sodium (Glycine NaOH( 0,1 M) + NaCl (0,5M) tamponné à pH 10). Ce tampon contient donc Na+ et Cl- en fortes concentrations par rapport au lysozyme. Na+