électrophorèse de protéines électrotransfert et immunorévélation
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Compte rendu TP électrophorèse de protéines électrotransfert et immunorévélationI) But du TP
Lors du premier TP, nous avions essayé de purifier une protéine du blanc d’œuf, le lysozyme, par chromatographie échangeuse d’ions. Dans ce TP, nous allons vérifier cette purification à l’aide d’une électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Puis afin d’identifier précisément l’enzyme nous effectuerons un électro-transfert suivi d’une immunorévélation.
II) Principe
A°) Electrophorèse
L’électrophorèse est une méthode d’analyse et de séparation basée sur la migration différentielle de particules chargées sous l’influence d’un champ électrique continu. La migration se fait au sein d’une phase liquide imprégnant un solide poreux ou un gel. Ainsi, les molécules chargées positivement migrent vers la cathode (chargée négativement) et celles chargées négativement vont vers l’anode (positive). On aboutit alors à la séparation des fractions protéiques sous forme de zones distinctes.
Ici, on utilise le gel de polyacrylamide en milieu dénaturant (en présence de SDS). L’électrophores se compose de deux étapes :
1-Dénaturation des protéines à chaud à 95°C puis en présence de SDS :
Les molécules seront séparées ici seulement en fonction de leur masse moléculaire grâce à la méthode SDS-PAGE. Le SDS (sodium dodécylsulfate) est un détergent anionique CH3(CH2)10CH2OSO3-, qui se lie fortement aux protéines et les dénature en les chargeant négativement (les protéines perdent leur structure tridimensionnel (dépliement) puis se chargent négativement (macropolyanions)).
2- Migration des protéines dans le gel :
Les protéines, chargées négativement, migrent vers l’anode (pole +), mais à des vitesses différentes. Le gel de polyacrylamide est finement réticulé et à une structure poreuse. Il résulte de la polymérisation d’acrylamide CH2=CHCONH2 et de bis-acrylamide (CH2=CHC0NH)2CH2 en présence de catalyseurs : la polymérisation est initiée par une réaction radicalaire : le persulfate