Compte rendu de tp : purification de lysozyme à partir de blanc d'oeuf
2272 mots
10 pages
Compte rendu de TPPurification de lysozyme
I/ But
Le but de ce TP est la purification de lysozyme, une enzyme qui se localise dans le blanc d’œuf. Pour ce faire, nous allons procéder en trois grandes étapes :
1) Dans un premier temps, nous utiliserons la chromatographie d’échanges d’ions pour séparer les constituants de notre mélange.
2) Dans un deuxième temps, nous mesurerons l’activité enzymatique de l’enzyme d’intérêt par un dosage enzymatique.
3) Enfin, nous procéderons à un dosage des protéines par un dosage colorimétrique de Bradford.
II/ Principe : la chromatographie d’échanges d’ions
La séparation des constituants d’un mélange par chromatographie d’échange d’ions repose sur l’adsorption réversible de molécules chargées sur une résine de charge opposée.
Comme toute chromatographie, la séparation se fait en fonction de l’affinité d’un constituant pour les deux phases : stationnaire et mobile. L’affinité d’un échangeur d’ions pour une molécule varie en fonction de la charge électrique de cette molécule, de son pHi et du pH du tampon.
En effet, un ion chargé positivement sera lié à la résine chargée négativement par interactions électrostatiques. Il y’a donc un échange entre l'ion et la molécule à isoler (cf. schéma ci-dessous). Après élution par un tampon adéquat on va pouvoir recueillir la molécule qu’on a souhaité isoler.
[pic]
Le lysozyme possède un pHi relativement élevé (pHi=11) par rapport aux autres protéines contenues dans le blanc d’œuf : c’est cette propriété que l’on utilise pour faire la séparation. En effet, les autres protéines (conalbumine, ovalbumine et ovomucoide) ont respectivement des pHi de 6.8, 4.6 et 4. Lorsque la résine sera équilibrée à un pH 8.2, ces protéines seront chargées négativement alors que le lysozyme sera le seul ion chargé positivement.
Pour cette chromatographie,