Lycée J.Moulin Pézenas – janvier 2003 Atelier scientifique OGM

D’après Biotechnology explorer – pGLO bacterial transformation kit

Protocole de transformation bactérienne
La souche bactérienne E.coli HB101 a été sélectionnée en vue d’une transformation efficace et sécurisée : naturellement non pathogène, sa résistance aux défenses immunitaires humaines ont été encore diminuées ses composants de surface et son équipement enzymatique favorisent l’adhésion, la conservation et l’expression du plasmide dépourvue de plasmides naturels, elle ne peut pas, non plus, après transformation, échanger le plasmide avec d’autres bactéries, ses besoins nutritifs stricts l’empêchent de se développer hors de son milieu de culture au laboratoire, Expliquer l’intérêt des particularités de la souche bactérienne choisie … La culture de départ a été ensemencée la veille et incubée une nuit à 37°C. Les bacté ries de cette culture sont en phase de division, ce qui les rend particulièrement aptes à intégrer un plasmide : elles sont qualifiées de « compétentes ». Noter l’aspect des colonies bactériennes de cette culture de départ …

Dans un tube de transformation, marqué +pGLO, le plasmide va être mis au contact de la suspension bactérienne. Un tube de contrôle, marqué –pGLO, où les bactéries ne seront pas transformées, sera utilisé, tout au long du protocole, comme témoin négatif.

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Les gènes insérés sur le plasmide sont : Amp : résistance à un antibiotique, l’ampicilline GFP : synthèse d’une protéine fluorescente, la GFP araC : active, en présence d’arabinose dans le milieu, la transcription du gène GFP 1. Marquer 2 micro-tubes +pGLO et –pGLO, les fermer et les placer sur un portoir flottant. 2. A l’aide d’une micro-pipette à embout stérile, transférer 250 µl du tampon de transformation (tubeTT de CaCl2) dans chaque micro-tube. 3. Placer les tubes sur leur portoir dans de la glace pilée. 4. A l’aide d’un anse stérile, prélever une colonie bactérienne isolée dans la boîte