Issu d'un père médecin et républicain convaincu, Berthelot fit de brillantes études au lycée Henri-IV, s'intéressant entre autres à l'histoire et à la philosophie. C'est là qu'il fit la connaissance de Renan qui avait quitté le séminaire et travaillait dans cet établissement comme maître d'études ; ils nouèrent une amitié qui devait durer jusqu'à la mort[2]. En effet, c'est à la Faculté des sciences de Paris qu'il entra par la suite. Il commença vraiment ses recherches dans le laboratoire privé de Théophile-Jules Pelouze, où il pouvait expérimenter à sa guise. Il entra au Collège de France comme préparateur d'Antoine-Jérôme Balard, son ancien maître, en 1851.

Comme plusieurs autres chimistes de son temps, Berthelot commença ses recherches sur des composés organiques de nature assez complexe. Il obtint son doctorat en 1854 grâce à sa thèse sur la structure et la synthèse des graisses et sur les combinaisons du glycérol avec les acides. Berthelot a fait sur les synthèses beaucoup de recherches fructueuses. Mais le domaine de ses intérêts était extrêmement large, et il est aussi l'auteur d'études historiques sur les alchimistes du Moyen Âge.

Berthelot a été professeur à l'École supérieure de pharmacie en 1859, puis professeur de chimie organique au Collège de France en 1865 (la chaire avait été créée à son intention). Il fut inspecteur général de l'Enseignement supérieur en 1876.

Il a occupé les fonctions ministérielles suivantes :

* Ministre de l'Instruction publique et des Beaux-arts, du 11 décembre 1886 au 17 mai 1887, dans le gouvernement René Goblet * Ministre des Affaires étrangères, du 1er novembre 1895 au 23 avril 1896, dans le gouvernement Léon Bourgeois

Marcellin Berthelot était un espérantiste distingué, dont le souvenir fut salué par Zamenhof lors du Congrès de Cambridge le 12 août 1907. Il était membre du Comité de Patronage de ISAE (Internacia Scienca Asocio Esperantista = Association Internationale Scientifique Espérantiste).