TP : ETUDE EXPERIMENTALE DE LA PHOSPHATASE ALCALINE

BUT
Nous allons déterminer les paramètres cinétiques d’une enzyme en étudiant l’influence de la concentration en substrat et celle de la présence d’un inhibiteur dans le milieu réactionnel. On va mesurer l’activité de l’enzyme en mesurant par spectrophotométrie l’apparition du produit de la réaction qui sera coloré.

PRINCIPE
Nous allons utiliser dans ce TP la phosphatase alcaline de veau. C’est une enzyme à 2 substrats qui à un pH optimal alcalin et qui hydrolyse les monoesters phosphoriques selon la réaction suivante :
R-O-PO32- + H2O  R-OH + HPO42-

Dosage spectrophotométrique
Un dosage spectrophotométrique permet de mesurer l’absorbance d’une substance colorée au cours du temps car elle absorbe à une longueur d‘onde donnée. Pour notre TP, le spectrophotomètre est relié à un ordinateur pour permettre de visualiser l’évolution de l’absorbance d’une solution de concentration donnée en substrat, autrement dit l’évolution de la réaction enzymatique, pendant un intervalle de 3 min. Cela nous permet de déterminer ensuite la vitesse initiale de la réaction en déterminant la pente de la tangente à la courbe qui passe par le 0. On détermine donc le ΔDO/min pour les temps initiaux de la réaction.
Pour notre dosage, nous utiliserons un substrat synthétique incolore ; le p-nitrophénolphosphate (PNPP) car, après action de l’enzyme, on obtient le p-nitrophénol (PNP) qui est un chromophore. C’est un produit coloré et il est directement dosable par spectrophotométrie à 410 nm.
Equation de la réaction : PNPP + H2O  2 PNP + HPO42-

Gamme étalon
La réalisation d’une gamme étalon nous permet de déterminer, pour une absorbance donnée, la concentration inconnue de produit formé lors de la réaction.
Pour réaliser la gamme étalon, tous les tubes doivent avoir le même volume final. Les volumes de réactif doivent rester constants et les