Polymerase chain rection

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  • Publié le : 5 décembre 2011
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Historique :
Cette méthode de Biologie Moléculaire a été mise au point en 1985 par Kary Mullis, qui obtint pour ces travaux le prix Nobel de Chimie en 1993. Aujourd’hui, ce procédé révolutionnaire couplé à l’utilisation d’une ADN polymerase thermorésistante permet d’obtenir, sans clonage, une amplification considérable d’un fragment donné d’ADN.
Principe :
La réaction PCR (Polymerase ChainReaction) permet d'amplifier in vitro une région spécifique d'un acide nucléique donné afin d'en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier.
Pour se faire, une série de réactions permettant la réplication d’une matrice d’ADN double brin est répétée en boucle. Ainsi, au cours de la réaction PCR, les produits obtenus à la fin de chaque cycle servent de matrice pour le cycle suivant,l’amplification est donc exponentielle.
Pour avoir réplication d’un ADN double brin, il faut agir en trois étapes. (1) Il faut dénaturer l’ADN pour obtenir des matrices simple brin ; (2) borner et amorcer la réplication de la séquence à amplifier à l’aide d’oligonucléotides amorces spécifiques ; (3) réaliser la réaction de polymérisation du brin complémentaire. A la fin de chaque cycle, lesproduits sont sous forme d'ADN double brin.
Les trois étapes, constituant un cycle de PCR, sont effectuées à des températures différentes permettant de contrôler l’activité enzymatique. Pour effectuer ces transitions de températures, les microtubes contenant le mélange réactionnel sont placés dans un appareil programmable : un thermocycleur. Cet appareil permet d’exposer les tubes à des températureschoisies et pour des durées déterminées par l’expérimentateur. La réaction PCR est extrêmement rapide et ne dure que quelques heures (2 à 3 heures pour une PCR de 30 cycles).
Pour réaliser une amplification sélective du fragment recherché, l’expérimentateur va devoir optimiser les conditions expérimentales. Dans les chapitres suivants, vous trouverez quelques informations pour comprendre lescritères et les limites dans le choix des différents paramètres.
Les amorces :
Dans la mise au point de la réaction PCR, le choix des amorces est crucial. Elles vont avoir un double rôle : en s'hybridant à l'ADN matrice, elles délimitent la région d’ADN à amplifier (étape 2 du cycle) et avec leur extrémité 3' OH libre servir d’amorce pour l’ADN polymérase (étape 3 du cycle).
Lesoligonucléotides amorces s’hybrident aux extrémités de la séquence qui va être amplifiée, il faut donc connaître les séquences nucléotidiques des extrémités de la région ADN amplifiée. C'est en effet au niveau de ces extrémités que les oligonucléotides amorces vont s'hybrider. Pour faciliter le choix des séquences des deux amorces, des logiciels d’analyse de séquences permettent de vérifier les points suivants :• des Tm comparables. Les oligonucléotides amorces doivent s’hybrider à l'ADN matrice dans les mêmes conditions de température,
• des séquences qui ne soient pas complémentaires entre elles (en particulier dans la région 3’),
• des séquences qui ne contiennent pas de séquences répétées inversées (pas de repliement intramoléculaire).
Il est alors possible de faire synthétiser les deuxoligonucléotides (d'une vingtaine de bases). La synthèse chimique d'ADN permet d'obtenir des oligonucléotides dont l'extrémité 5' n'est pas phosphorylée (5'OH) contrairement aux ADN "dits" naturels. Ainsi, tous les fragments d'ADN amplifiés par PCR sont déphosphorylés à leurs extrémités 5'.
Les températures :
Les trois étapes, constituant un cycle de PCR, sont effectuées à des températures différentespermettant de contrôler l’activité enzymatique :
• l’étape de dénaturation, est réalisée à environ 95°C, pour une dissociation complète des deux brins d’ADN.
• l’étape d’hybridation se fait à une température qui sera définie selon la nature des amorces (cette température varie de 50 à 60°C). Cette température va déterminer la stabilité des hybrides une fois que l’appariement amorces / matrice...
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