TP de génie génétique

Transformation de bactéries rendues compétente par un traitement au chlorure de calcium Puis la préparation et l’analyse d’ADN plasmidique

Transformation d'E.coli rendues compétente par un traitement au chlorure de calcium
Principe
1) préparation des cellules compétentes
Avant le début du TP, les cellules à traité ont été préalablement mis culture jusqu’à leur phase exponentielle de croissance, car dans cette phase les cellules sont en division ce qui facilitera la transformation car les membranes en cours d’allongement sont plus fragile.
Ensuite, nous avons centrifugé notre culture E.coli pendant 10 minutes à 2500 rpm afin de concentrer les cellules. Après cela, nous avons re-suspendus le culot dans un tampon contenant un tampon Tris HCl et CaCl2 afin de les rendre compétentes pour la transformation. En effet, en présence d’une solution concentré en ions Ca la structure des membranes cellulaire va être altéré et il y aura la création de plusieurs micro perforations par lesquels l’ADN pourra pénétrer les cellules vont être capables d’ingérer des petites molécules d’ADN, comme un plasmide. Toutes les opérations ont été effectuées à 4°C afin de ne pas endommager les bactéries. .

2) Transformation des cellules compétentes
Dans cette étape nous avons mélangé les cellules d’E.coli rendues artificiellement compétente avec de l’ADN plasmidique et nous avons laissé reposer ce mélange pendant 30 minutes afin d’accentuer la réaction précisé précédemment. Puis nous avons mis ce mélange 1 minute à 42°C, ce choc thermique induit un stress important qui fragilise la membrane et facilitera l’entrée de l’ADN plasmidique dans les cellules d’E.coli compétentes. Une fois cette étape terminé nous avons remis le tube dans la glace afin d’effectuer un deuxième choc thermique qui lui permettra d’intégrer le plasmide dans la cellule. Après cela nous avons ajouté à notre tube du milieu Soc afin de régénérer la membrane bactérienne au plus