Transformation de bacteries rendues competente par un traitement au chlorure de calcium puis

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  • Publié le : 1 avril 2011
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TP de génie génétique

Transformation de bactéries rendues compétente par un traitement au chlorure de calcium Puis
la préparation et l’analyse d’ADN plasmidique

Transformation d'E.coli rendues compétente par un traitement au chlorure de calcium
Principe
1) préparation des cellules compétentes
Avant le début du TP, les cellules à traité ont été préalablement mis culture jusqu’àleur phase exponentielle de croissance, car dans cette phase les cellules sont en division ce qui facilitera la transformation car les membranes en cours d’allongement sont plus fragile.
Ensuite, nous avons centrifugé notre culture E.coli pendant 10 minutes à 2500 rpm afin de concentrer les cellules. Après cela, nous avons re-suspendus le culot dans un tampon contenant un tampon Tris HCl et CaCl2afin de les rendre compétentes pour la transformation. En effet, en présence d’une solution concentré en ions Ca la structure des membranes cellulaire va être altéré et il y aura la création de plusieurs micro perforations par lesquels l’ADN pourra pénétrer les cellules vont être capables d’ingérer des petites molécules d’ADN, comme un plasmide. Toutes les opérations ont été effectuées à 4°C afinde ne pas endommager les bactéries. .

2) Transformation des cellules compétentes
Dans cette étape nous avons mélangé les cellules d’E.coli rendues artificiellement compétente avec de l’ADN plasmidique et nous avons laissé reposer ce mélange pendant 30 minutes afin d’accentuer la réaction précisé précédemment. Puis nous avons mis ce mélange 1 minute à 42°C, ce choc thermique induit unstress important qui fragilise la membrane et facilitera l’entrée de l’ADN plasmidique dans les cellules d’E.coli compétentes. Une fois cette étape terminé nous avons remis le tube dans la glace afin d’effectuer un deuxième choc thermique qui lui permettra d’intégrer le plasmide dans la cellule. Après cela nous avons ajouté à notre tube du milieu Soc afin de régénérer la membrane bactérienne au plusvite. Après nous avons mis à agiter nos tube à 37°C pendant 45 minutes ce qui a permis aux cellules ne se divisent pas mais « réparent » leurs membranes ce qui a permis de continuer la régénération de E.coli à sa température optimal .Cette étape a également permis d’obtenir la synthèse de la protéine qui confère la résistance à l’antibiotique. Enfin nous avons ensemencé les cellules transforméessur un milieu LB solide additionné d'antibiotique afin d'identifier les cellules qui contiennent l'ADN plasmidique.

Résultats

Interprétation

PREPARATION ET L’ANALYSE D’ADN PLASMIDIQUE

Principe
3) Préparation d’ADN plasmidique
Les bactéries ont été dans un premier temps ensemencé et laisser pousser une nuit dans un milieu LB/Amp. Cela a permis de réaliser une croissance de cesdernières dans les conditions de systèmes sélectifs adéquats.
Ainsi lors de notre arrivé en TP nous avons tout abord effectuer une centrifugation puis une élimination du surnageant afin de récupérer le culot contenant les bactéries.
Ensuite nous avons re-suspendu dans la solution 1, qui contient du Tris HCl (afin de stabiliser le pH) et de l'EDTA. Ce dernier va chélater les cations métalliquesdivalents mais majoritairement le calcium et le magnésium, ce qui va déstabiliser la membrane bactérienne, et permet d’inactiver les DNases.

Après cela nous avons lysées ces bactéries en y introduisant la solution 2. Effectivement, cette solution contient du NaOH ainsi que du SDS, qui sont respectivement de la soude et du détergent. Ainsi, Les parois bactériennes ont été fragilisées à pH basique, etce pH basique permet également de séparer les deux brins de l'ADN. Ainsi, Le chromosome bactérien très fragile se linéarise en grands fragments, par contre les deux brins des plasmides, beaucoup plus petits, restent circulaires et donc demeurent associés.

Après 3 minute d’incubation (le temps a dû être respecté car sinon la lyse aurai été trop importante) , nous avons ensuite introduit la...
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