EXTRACTION DES PROTEINES DE LEVURE PRINCIPE Plusieurs méthodes sont utilisées pour lyser des cellules de levures (pression osmotique, pression mécanique). Celle qui est présentée ici consiste à lyser les cellules de levure en présence de billes de verre et sous l’action de la chaleur. Les protéines sont par ailleurs dénaturées en présence d’un détergent, le dodécyl sulfate de sodium (SDS) qui charge négativement les protéines; cette dénaturation s’accompagne d’un traitement avec un agent réducteur comme le β-mercaptoéthanol ou le dithiothreitol (DTT) de façon à rompre les ponts disulfure des protéines et dissocier les sous-unités. Le nombre de molécules de SDS fixées sur une molécule de protéine dépend de sa masse moléculaire (environ 1,3 g par gramme de protéine). MATERIEL - Tubes Eppendorf stériles de 1,5 ml et micro centrifugeuse SOLUTIONS - Billes de verre (0,45 mm de diamètre, Glasperlen Braun Biotech International) - Solution de Laëmmli 2 X (à conserver à -20°C) :
Tris-HCl (pH 6,8) SDS (p/vol) β-mercaptoéthanol (vol/vol) Glycérol pur (vol/vol) Bleu de Bromophénol (p/vol) 125 mM 4% 1% 20% 0,05% pour 10 ml 1,25 ml de 1 M 2 ml de 20% 100 µl 2 ml 50 mg

PROTOCOLE
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Ensemencer les souches de levure dans des tubes de culture contenant 3 ml de milieu approprié (sélectif non inducteur dans le cas étudié ici). Incuber pendant la nuit à 30°C avec agitation. Mesurer la DO600nm d'une dilution au 1/10 des cultures de la nuit. Centrifuger un volume correspondant à un total de 10 unités de DO600nm de chaque culture pendant 5 min à 4 000 t/min. Resuspendre le culot dans 2 ml d’eau distillée stérile. Transférer en tube Eppendorf de 2,2 ml et effectuer 2 lavages en resuspendant les cellules dans 2 ml d’eau distillée stérile. Diluer les cellules à 1 unité de DO600nm par ml dans un erlenmeyer contenant 10 ml de milieu approprié (sélectif inducteur dans le cas des TP). Incuber pendant 3 h à 30°C avec agitation. Mesurer les DO600nm sur 1 ml des cultures. S'il y a