Etude de la cinétique d'apparition

Pages: 5 (1137 mots) Publié le: 13 janvier 2011
Etude de la cinétique d'apparition / disparition des gènes au cours de la différenciation des iPs en corps embryoïdes

Phe Amandine, Guyot Alexandre

Abstract:

Une cellule souche ayant besoin d'un milieu bien particulier pour pouvoir se développé, nous avons reconstitué un milieu de culture de cellule souche afin de pouvoir faire vivre ces dernières en dehors de leurs naturel.L'utilisation de feeders (fibroblastes de souris ) s'est alors révélé nécessaire pour assurer le bon développement des cellules dans le nouveau milieu.

Nous avons ensuite différencié nos iPS en EB et, afin de vérifié que cette étape se soit bien déroulé, nous avons effectué une récupération de l'ADN grâce a un marqueur fluorescent. En effet la récupération des ARN permet de savoir si on est bien passédes ips au IB, car chaque transcriptome est propre à la cellule.

Enfin, nous avons suivi l'évolution des cellules pluripotentes en cellules différencié ( Keratinocyte ) en surveillant l'activité de certains gènes en les amplifiant par une technique de PCR.

Introduction:

Les récents travaux de l'équipe japonaise dirigée par le professeur Shinya Yamanaka de l'université de kyoto sur lescellules reprogrammées génétiquement, de manière à redécouvrir un état de pluripotence, d'ou leur dénomination de cellules souches pluripotentes induites ou ips, ont révolutionné l'approche de la médecine régénérative.

Un des défis de cette nouvelle technologie est en effet le contrôle de la qualité des cellules obtenues. Parce qu'elles ont justement le même potentiel biologique que les cellulessouches embryonnaire, les iPS peuvent théoriquement entraîner des proliférations tumorales chez l'organisme receveur.

L'étude de la cinétique d'apparition / disparition des gènes au cours de la différenciation des iPs en corps embryoïdes jouera donc un rôles important dans l'optique d'obtenir une culture cellules humaines différencié comme des cellules de peau par exemple.

Nous avons pourcela développé une méthode afin de faire vivre les cellules souches hors de leurs milieux naturels puis nous avons , grâce à des marqueurs fluorescents, extraits des ARNs afin de pouvoir suivre, en ciblant précisément certains gènes, l'évolution cinétique de la différenciation de nos cellules pluripotentes en keratinocyte.

Matériels et Méthodes:

On veut faire vivre les cellules hors de leursmilieu naturel et on travail sous hôte à flux laminaire, en zone stérile.

 Culture cellulaire avec des cellules isolées (passage des feeders) :
Utilisation de fibroblastes de souris dans une fiole F25. On les décrochent avec de la trypcine et ont les réensemencés pour ensuite les comptés grâce à l'utilisation d'un bleu tripant.

 Culture cellulaire :
Utilisation d'iPs, de la mitomycine Cet du milieu contenant du FGF2. Le milieu est retiré et on ajoute de la collagenase. Du milieu sans FGF2 est additioné sur les cellules ainsi que de l'antibiotique. On prend du milieu d'iPs pour les réensemencer. Ils vont être ensuite utilisé dans l'extraction des ARNs.

 Extraction des ARNs :
On récupère le milieu contenant les EB précédemment obtenus et on ajoute du trizol contenant lescellules après élimination du surnageant. La première étape est la phase de séparation. On obtient 3 phases. La phase d'intérêt est isolée. On la précipite la phase par addition d'isopropanol. On élimine le surnageant par lavage à l'éthanol puis on redissout dans de l'eau. Une électrophorèse sur gel d'agarose a été faite pour comparer les ARNs obtenus.

 Suivie de l’évolution dans le temps de ladifférenciation des iPS en cellules différenciées :

Nous avons fait dans un premier temps synthétiser de l’ADN à partir de notre ARN pour cela nous avons utilisé des randoms primers et nous avons ensuite effectué une PCR en utilisant certains oligos afin d’amplifier les zones voulues (RT-PCR). Enfin nous avons effectué une électrophorèse pour vérifier la présence des gènes ciblés à différents...
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