Manipulations de biologie moléculaire : mise en évidence de l’arn messager de p53 (protéine « suppresseur » de tumeur) dans une lignée cancéreuse érythroleucémique humaine (hel)

Pages: 15 (3626 mots) Publié le: 12 février 2012
Manipulations de biologie moléculaire :
mise en évidence de l’ARN messager de P53 (protéine « suppresseur » de tumeur) dans une lignée cancéreuse érythroleucémique humaine (HEL)

Sommaire

INTRODUCTION
1 Présentation de la protéine P53
2 Culture cellulaire
3 Extraction et dosage des ARN totaux
4.1 Principe
4.2 Protocole expérimental
4.3.1 Extraction (àpartir du kit RNeasy Mini Kit, QIAGEN)
4.3.2 Dosage
4.3 Interprétation des résultats

4 Transcription inverse
5.4 Principe
5.5 Protocole expérimental
5.6 Migration électrophorétique sur gel d’agarose

5 Réaction de polymérisation en chaine (PCR)
6.7 Principe
6.8 Protocole expérimental

6 Identification du produit de PCR parélectrophorèse sur gel d’agarose
7.9 Principe
7.10 Mode opératoire de l’électrophorèse
7.11.3 Gel d’agarose à 2 %
7.11.4 Préparation de l’échantillon et migration électrophorétique
7.11 Interprétation des résultats

7 Digestion enzymatique par une enzyme de restriction du fragment d’ADN amplifié par PCR
8.12 Principe
8.13 Protocole expérimental8.14.5 Gel d’agarose à 2 %
8.14.6 Préparation de la digestion enzymatique par Pvu II et migration électrophorétique
8.14 Interprétation des résultats

CONCLUSION

INTRODUCTION

Nous allons mettre en évidence un type d’ARN messager de p53, que l’on trouve dans une lignée cancéreuse érythroleucémique humaine.

Au cours des séances, nous utilisons une lignée HEL qui aété obtenue en cultivant des cellules mononucléées du sang circulant d’un malade présentant une érythroleucémie, après rémission d’une maladie de Hodgkin.

La première étape consiste à extraire et doser les ARN totaux. Puis, nous effectuerons une transcription inverse réalisée en vue d’une réaction de polymérisation en chaine, la PCR.

Pour terminer nous identifierons les produits de PCR, parélectrophorèse sur gel d’agarose et nous réaliserons une digestion enzymatique (grâce à l’enzyme de restriction Pvu II) du fragment d’ADN amplifié par PCR.

Nous pourrons ainsi déterminer la taille des fragments d’ADN de l’échantillon.

1 La protéine P53

* La protéine P53 est un facteur de transcription qui régule des fonctions cellulaires importantes. Quand la cellule estendommagée, selon la nature du préjudice, P53 est activée, soit pour contrôler la croissance cellulaire, soit pour induire le suicide de la cellule.

* Depuis plusieurs années, la compréhension des fonctions de P53 et des moyens de la réguler constitue un important défi de la recherche contre le cancer.

* L’obtention d’une cellule cancéreuse nécessite un environnement instable qui va permettreà la cellule d’acquérir de nombreuses mutations d’oncogènes ou de gènes suppresseurs de tumeur.

* L’altération du gène P53 est due à l’exposition à différents agents capables de provoquer un cancer, ou carcinogènes tels que tabac pour les cancers bronchiques, rayons UV pour les cancers de la peau ou alcool pour les cancers du foie.

* D’une grande importance dans la protection descellules, la protéine P53 les préserve contre les différentes atteintes qu’elles peuvent subir. En cas de dommage d’une cellule, P53 bloque sa croissance cellulaire et permet sa réparation.

* Si le stress est trop important, P53 induit même le suicide de la cellule, ou apoptose, ce qui inhibe la multiplication de cellules défectueuses. Cette protéine prévient ainsi la transformation des cellulesde notre organisme en cellules cancéreuses et correspond au plus important facteur suppresseur de tumeurs. Effectivement plus de 50% des cancers humains résultent de l’altération du gène P53.

* Depuis quelques années on sait que le gène P53 peut conduire à l’expression de différentes formes de la protéine, qualifiées d’isoformes.

* Finalement l’activation spécifique des...
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