TP d’Immunologie
Titrage d’un sérum de lapin par Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA).

But de la manipulation * Savoir manipuler le matériel utilisé pour réaliser un test ELISA * Connaître les méthodes de dilution * Mise en évidence de la présence d’anticorps spécifiques anti-BSA (Albumine Sérique Bovine) dans le sérum d’un lapin immunisé par la BSA * Titrage de la réactivité anticorps par une technique immuno-enzymatique (ELISA).

Principe de l’ELISA
Le principe de la réaction est le suivant : on fixe l’antigène (BSA) sur les parois d’une plaque de polystyrène à 96 puits. L’antigène s’adsorbe spontanément à pH alcalin sur le support plastique spécialement étudié. L’excès d’antigène non adsorbé est éliminé par lavages successifs. On ajoute ensuite dans chaque puits le sérum à tester aux concentrations choisies. Après une heure d’incubation, des lavages permettent d’éliminer les anticorps non fixés. On rajoute alors un anticorps anti-immunoglobuline couplé à une enzyme (le conjugué). Après une seconde incubation, le conjugué en excès est éliminé par lavages et l’on dépose dans les puits le substrat de l’enzyme. L’hydrolyse de ce substrat incolore par l’enzyme présente dans les puits donne un produit coloré dont l’absorbance est mesurée par spectrophotométrie. L’intensité de la coloration est fonction du titre en anticorps anti-BSA présent dans le sérum testé.

Méthode d’expérimentation
Moyens et réactifs On dispose de réactifs de départ que l’on devra diluer par la suite : * BSA 10%. * Dilution au 1/100 de deux sérums de lapin (normal et anti-BSA) et de quatre fractions F1 à F4 issues de la purification du sérum anti-BSA par chromatographie d’affinité. * Tampon PBS-Tween 10x à 1%. * Solutions à pH acide, basique, ou contenant les détergents NP 40 et SDS.
On a réalisé des dilutions en cascade des différents réactifs dans une plaque de 96 puits (dont on n’utilisera que la moitié) différente de la plaque «