Absorbance

électroniques : ultraviolet et visible c) Les spectroscopies vibrationnelles d) Les spectroscopies rotationnelles e) Les spectroscopies magnétiques ou de spin f) Spectrométrie de masse 4) LOI DE BEER-LAMBERT a) Démonstration et énoncé b) Additivité des absorbances c) Limites 5) SPECTROPHOTOMETRE a) Eléments constitutifs b) Un exemple : spectrophotomètre ultraviolet-visible c) Sources d) Transparence des supports 6) ALLURE DU SPECTRE page 8 page 9 page 10 page 13 page 14 page 17 SPECTROSCOPIE

obtenues pour les colorants sont représentées sur la figure 1 ci-dessous et celle obtenue pour le sirop de menthe dilué est représentée sur la figure 2. absorbance A Colorant jaune (tartazine) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 360 400 440 480 520 560 600 640 680 720 longueur d’onde λ en nm absorbance A Colorant bleu (bleu patenté V) 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 Figure 1 0 360 400 440 480 520 560 600 640

aromatique, seul groupement absorbant dans l'UV ici. Mais, la différence de la valeur d'absorbance observée se justifie par la présence d'une quantité d'aromatiques plus importante dans le mélange d'alkylbenzènes que dans le toluène. Nous avons une absorbance maximale de l'aromatique à 261 nm, longueur d'onde à laquelle nous allons travailler en HPLC. La spectrométrie UV est une très bonne méthode de détection des aromatiques mais elle ne permet pas de séparer nos différents alkylbenzènes, c'est pourquoi

l'absorbance 0,253 du tube 1. Le tube 3 approuve le fait que c'est là presence de ferrocyanure de potassium agissant avec le fer qui est à l'origine d'un tel resultat d'absorbance. Car l'eau remplacant le ferrocyanure de potassium donne une absorbance (0,04) non significatif; Calcul: A1-A3 = 0,253-0,04 = 0,213 0,213 correspond à l'absorbance du complexe fer. On a 37,7 mg/L de complexe fer dans notre echantillon.

le TP, nous avons rencontré quelques difficultés. Dans les résultats obtenus, il y a des erreurs car dans la chromatographie, nous avons qu'un seul pic. Cela doit être du à des erreurs de manipulation lors de la préparation et de la mesure des absorbances.

déterminer le nombre de tyrosines contenues dans la caséine.   T 1 2 3 4 5 6 7 8 Tyrosine (mg/L) 0 10 20 30 40 50 39 39 37 Tyrosine (µL) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1       HCl qsp 1mL 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0       Absorbance 0 0,07 0,13 0,21 0,28 0,35 0,27 0,27 0,26 La concentration massique en tyrosine libre de cet hydrolysat est d’environ Cm(p)=39.10-3g/L (NB : pour les deux étudiants Cm(p) est le même) obtenus à l’aide de la courbe d’étalonnage

l’échantillon à doser Lavage pour éliminer tous les anticorps en excès Tous les antigènes sont occupés Ajout d’enzymes spécifiques aux anticorps. E Ajout d’un substrat spécifique à l’enzyme : produit coloré Coloration détectée par absorbance. ES ES E Plus la solution est colorée et plus la quantité d’analyte est faible 15 I . LC/TOF-MS avec APPI II. Electrophorèse capillaire MS-ESI III. Méthode immunologique: ELISA IV. Comparaison des méthodes V. Méthode sélectionnée

par la présence de cyanure, tampon phosphate ou succinate puisqu’elle est négligeable pour eux à cette valeur. La réaction permettant la mesure de cette activité peut être schématisée comme montrée en Figure 1. Résultats Les mesures d' absorbance des mélanges 2 et 3, nous permettent d'obtenir deux courbes différentes : Pour la courbe du mélange 2 (bleue), on observe une légère augmentation de l’absorbance en fonction du temps, puis un plateau. La montée de la courbe s’explique par la

 sa
fréquence
ou
ses
fréquences
de
déformaBon

 hZp://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/molspec/irspec1.htm
 analyses
en
synthèse
organique
 9
 3)
Spectroscope
IR
 Tλ=Iλ/I0,λ

 On
travaille
plutôt
en
transmiEance
qu’en
 absorbance
 On
parle
en
nombre
d’onde
σ=1/λ (pas
en
 fréquence
ou
en
longueur
d’onde)
 échan;llon
 Intensité
incidente
I0,λ

 à
la
longueur
d’onde
λ
 Intensité
transmise
Iλ

 à
la
longueur
d’onde
λ
 analyses
en
synthèse
organique
 10


pour détecter les molécules, car c’est une méthode très sensible Exemple de la détection de l’ATP : MMATP = 506 g/mol ; 3000 Ci/mmol ; ε = 15400 M-1.cm-1  Après purification et Analyse, on obtient : Par Pesée : 1 µg soit 2 µmol (10-6) Par Absorbance : 0.1 soit 6 nmol (10-9) Par Radioactivité : 100 dpm soit 10-3 fmol (10-18) soit 1 milliard de fois plus précis que l’absorbance !! Les 3 types principaux de radiations nucléaires (α, β, ϒ) pénètrent dans la matière à des degrés différents.