Gozzoli arrive avec sa famille à Florence en 1427. Il se forme auprès de Fra Angelico au couvent San Marco où beaucoup d'œuvres sont exécutées depuis les dessins du maître, puis entre 1444 et 1447 comme orfèvre dans l'atelier de Ghiberti et travaille avec lui et son frère Vittorio Ghiberti à la porte du Paradis du baptistère Saint-Jean.

En mai 1447, il part à Rome avec Fra Angelico appelé auprès du pape Eugène IV pour des décorations au Vatican puis à la Cappella Niccolina de Nicolas V. Sa grande renommée de décorateur commence avec les fresques (disparues) peintes durant ce séjour, à l'église Sainte-Marie d'Aracœli (Saint Antoine et deux anges) et à Sainte-Marie-Majeure. Il le suit également en Ombrie lors de travaux de fresques sur la voûte de la cathédrale d'Orvieto.

En 1449, il quitte Fra Angelico et reste en Ombrie pour une Annonciation à Narni, signée OPU[S] BENOT[I] DE FLORENT[IA], au monastère de San Fortunato, près de Montefalco, pour une Vierge à l'Enfant avec saints et anges et d'autres travauxdont un retable de saint Thomas recevant la ceinture de la Vierge (musée du Latran), dans la chapelle de Saint-Jérôme la Vierge et les saints, la Crucifixion et d'autres sujets ; sa dernière peinture au monastère où il remplit de divers sujets sur la vie des saints dans lesquels il insère les portraits de Dante, de Pétrarque et de Giotto, travail terminé en 1452.

Il reste à Montefalco (avec un séjour à Viterbe) probablement jusqu'en 1456, employant Pier Antonio Mezzastris comme assistant. De là il part à Pérouse où il peint pour une église une Vierge et des saints (conservée au musée local) puis retourne dans la ville de son enfance, Florence.

Une fois de retour à Florence en 1459, il termine son chef-d'œuvre : le cycle de la chapelle des Mages du palais Medici-Riccardi à Florence et dans lequel il signe en se représentant avec un bonnet portant l'inscription latine OPUS BENOTII. Il choisit aussi les villes de la région, loin des grandes commissions du