Compte rendu tp thrombine l2 bio

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  • Publié le : 12 mai 2010
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Compte rendu du TP de Structure et Fonction des Protéines (BIO71).

Purification et Stabilité de la Thrombine.

Résumé:

Ce TP a pour but de purifier et de tester la stabilité de la thrombine, enzyme de la coagulation sanguine. La purification de la prothrombine comporte normalement 3 étapes: précipitation au chlorure de baryum, dialyse et chromatographie échangeuse d'ions.
Au cours de ceTP, nous avons pu réalisé que 2 de ces étapes: la précipitation et la chromatographie car l'étape de dialyse prend trop de temps. Durant la 1° étape, nous avons utilisé une méthode de précipitation au chlorure de baryum (BaCl2), ce qui nous a permis d’isoler de la prothrombine à partir de plasma sanguin.
La dernière étape de purification de la prothrombine est une chromatographie échangeused’ions sur une colonne de diéthyl-amino-éthyl DEAE chargée positivement.
Au cours de ce TP, nous avons donc pu isoler la prothrombine du plasma équin.

Introduction:

La thrombine (facteur II activé) est produite par le clivage de deux sites de la prothrombine qui est une protéine de la coagulation sanguine.
La thrombine est l'estérase terminale de la coagulation qui permet la transformationdu fibrinogène en fibrine. C'est également un puissant agent activateur plaquettaire. La thrombine possède des propriétés activatrices sur différents types cellulaires: par exemple les Protease Activated Receptors (PAR). Elle agit en clivant partiellement ces récepteurs.
La thrombine induit notamment la prolifération des cellules musculaires lisses, des fibroblastes et des cellules endothélialesen induisant la production de facteurs de croissance tels que le fibroblast growth factor (FGF), le vascular endothelial growth factor (VEGF) et leurs récepteurs.
La thrombine possède également des propriétés pro-inflammatoires telles que la production de prostaglandines, du facteur d'activation plaquettaire (PAF) ou l'expression de la P-sélectine.

Méthodes:

La précipitation au chlorure debaryum (BaCl2) est la 1° étape de purification de la prothrombine à partir du plasma équin.
Une précipitation est la formation d'une phase hétérogène au sein d'une autre phase, par exemple d'un cristal solide dans un liquide. La précipitation est un procédé de cristallisation rapide.
Dans ce TP, on réalise deux précipitations du plasma équin au BaCl2.
La 1° purification de la prothrombine auBaCl2 se fait à partir de plasma équin. On ajoute 80 µL de BaCl2 dans 1 mL de plasma. Après centrifugation, on récupère le culot C1 que l'on remet en suspension dans une solution saline SS diluée à 1:9. On récupère également le surnageant S1.
On réalise ensuite une 2° précipitation au BaCl2 et on récupère à nouveau le culot C2 que l'on remet en suspension avec de l'EDTA à 0,2M et la surnageantS2.

La chromatographie échangeuse d'ions est la 2° étape de purification de la prothrombine.
C'est un type de chromatographie en phase liquide permettant d'isoler une substance chargée électriquement d'un mélange de molécules chargées (liquide).
La phase stationnaire ici la colonne de chromatographie peut contenir soit des groupements fonctionnels anioniques (pour les échanges de cations)soit cationiques (pour les échanges d'anions).
Dans ce TP, la phase stationnaire est une colonne de diéthyl-amino-éthyl qui est chargée positivement. Avec une phase stationnaire contenant des cations, les anions de la solution progressent dans la colonne à des vitesses différentes selon leur charge, leur taille et leur polarisation. Les cations de la solution, eux, ne sont pas retenus lors de leurparcours dans la colonne.
On fait passer 3 tampons différents dans la colonne: trisodium citrate pH6, trisodium citrate 0,15M NaCl pH6 et trisodium citrate 0,5M NaCl pH6. On récolte 10 aliquots de 1mL pour chaque tampon.

Au cours des 2 précédentes méthodes, on réalise un test d'activité. C'est un test enzymatique de la prothrombine en utilisant un substrat chromogénique. Ce test permet de...
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