TSB 303 - Méthodes analytiques en biologie
Partie du Pr. Brian Talbot (60 points)

1. Lisez le texte suivant et répondez aux questions. (suggestion: Lisez les questions avant de lire le texte)

Nous avons dosé des anticorps bovines anti-Staphylococcus aureus par l'ELISA suivante : Le bactérie a été déposé dans les puits d'une plaque de microtitration en PVC (300 µl/puits d'une solution de 1ng/ml de bactérie purifié, dans 0,1 M NaHCO3 pH 9.0) et incubé 3 heures à 20oC. La plaque a été ensuite saturée avec 100 l/puits de 10 % sérum de souris dans PBS et incubée à 4oC pour la nuit. La plaque a été ensuite lavée 5 fois avec la solution de lavage (PBS contenant 0,05 % Tween-20).

Les antisérums bovins à tester a été ensuite déposés dans les puits (200 l d'une dilution 1 : 3000 dans l'eau distillée) en duplicata et incubés 2 heures à 4oC. On à vidé la plaque et ensuit on a ajouté 200 l d'un anticorps commercial chevre anti-bovin Ig-peroxydase. L'incubation de 30 minutes à 4oC a été suivie d'une autre série de 5 lavages. La réaction colorimétrie a été obtenue grâce à la solution chromogène (0,015 mg de TMB, 0,1 ml de peroxyde 30%, dans 30 ml de PBS) dont on a ajouté 200 l à tous les puits. La densité optique de chaque puits était lue après 15 minutes à 450 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.

Les microplaques ont 96 puits de volume 0,3 ml chacune. Nous avons utilisé :

78 puits pour les inconnus
6 puits pour les témoins positifs (anti-S.a. connu)
6 puits pour les témoins négatifs (pas d'anti-S.a)
6 puits pour les blancs sans antigène

a) L'ELISA n'a pas bien fonctionné. Une activité faible de peroxydase a été trouvée dans tous les puits incluant les blancs. Identifiez des erreurs dans le protocole et expliquez brièvement comment les corriger.

Réponse :
1. Faire un lavage après l’incubation suivant l’ajout de bactérie
2. Erreur majeure : Seulement 100 microlitres de la solution de saturation (blocage). Le sérum de souris agit comme solution de blocage. (On