Frans Pourbus commence par se distinguer comme portraitiste à la cour de Bruxelles où il peint l'archiduc Albrecht VII d'Autriche et son épouse Isabella Clara Eugenia. Il est remarqué par le duc de Mantoue, Vincent de Gonzague, qui est de passage à Bruxelles en septembre 1599, et qui l'invite à Mantoue. De 1599 à 1609, il réside à Mantoue, si ce n'est pour quelques voyages afin qu'il réalise des portraits des dames galantes de l'époque, qui orneront la Galeria di Bellezze, dans le palais ducal. Il côtoie Pierre Paul Rubens qui est aussi l'invité du duc entre 1601 et 1608.

Il est appelé à Paris par la sœur de la duchesse de Mantoue, qui est la reine de France, Marie de Médicis. Il vient une première fois pour un bref séjour à l'occasion du baptême de Louis XIII en 1606, puis il s'installe définitivement à Paris à partir de septembre 1609. Il a une fille en 1614 avec Elisabeth Francken, qu'il fait baptiser à l'église paroissiale sainte Elisabeth. En 1618, une pension annuelle lui est allouée en qualité de « peintre du roi » et, la même année, il est naturalisé français. Il est enterré le 19 février 1622 dans l'église des Augustins du faubourg Saint-Germain, à Paris.

C'est lui qui a permis d'implanter en France le portrait d'apparat. Grâce à la qualité exceptionnelle de ses portraits, il étendit la renommée des Pourbus à l'Europe entière.

Parmi ses œuvres marquantes, signalons le Portrait de Henri IV (cuirassé), le Grand Portrait en pied de la reine Marie de Médicis portant la somptueuse robe aux fleurs de lys de son sacre, un autre portrait de Marie de Médicis en habits noirs de deuil, ainsi que des tableaux à caractère religieux tels que Saint François recevant les stigmates et la Cène que le cardinal de Richelieu paya 10 000