Séance de préparation aux travaux pratiques

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Travaux pratiques

Blouse blanche indispensable !!!!

Gants latex

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Travaux pratiques

pipetteman

eppendorf
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Objectif du TP

Cloner des morceaux de l’ADN du phage lambda dans le vecteur (plasmide) pBluesscript

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Phages: Virus pour bactérie
Le bactériophage lambda est un virus d'E. coli

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Phages: Virus pour bactérie

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Génome du phage lambda
Le phage lambda possède au niveau de sa tête un génome de sous forme d'ADN double brin linéaire de 48,5kb

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Objectif du TP

Cloner des morceaux de l’ADN du phage lambda dans le vecteur (plasmide) pBluesscript

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Principe du TP
Jour 1
HindIII EcoRI HindIII Vecteur (plasmide) EcoRI ADN génomique de lambda

Première étape:
Coupure de l’ADN génomique par une ou plusieurs enzymes de restriction et ligation des fragments obtenus dans un vecteur de clonage.

Digestion

Ligation

ADN recombinant

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Principe du TP
Jour 1

Deuxième étape :
Insertion des molécules recombinantes dans les bactéries hôtes par transformation. Sélection et identification des clones ayant récupérés une molécule d’ADN recombinante et d’éliminer les clones ayant récupérés un vecteur « vide » (ex screen blanc/bleu ).
ADN recombinant 1 Sélection Transformation

ADN recombinant 2

…

Antibiotique + X-gal
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Les différentes étapes du TP (Jour 1)
1- Digestion de l’ADN avec des enzymes de restriction Eco R1 et Hind III. À la fin de la digestion, vous aurez produit plusieurs fragments d’ADN de tailles différentes. 2- Digestion d’un plasmide (pBluescript) avec Eco R1 et Hind III. Vous allez cloner les fragments de l’étape 1 dans ce plasmide. 3- Inactivation des enzymes de restriction. 4- Analyse par électrophorèse sur gel d'agarose des fragments d’ADN produits pendant les digestions 1 et 2. 5- Ligation des fragments produits dans l’étape 1 dans le plasmide, utilisant une ligase (une « colle moléculaire »). 6- Introduction des