BCH2008L Enzymologie et Métabolisme
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Page | 1 ETUDE CINETIQUE DE LA PHOSPHATASE ALCALINE
Les phosphatases ou phosphomonoestérases (EC 3.1.3.1) sont des enzymes qui hydrolysent les monoesters phosphoriques avec formation d’un ion phosphate et d'un alcool (ou d’un phénol), selon la réaction :
R-O-PO3
2- + H2O  R-OH + HPO4
2-
Méthodologie
Le but du TP est d’étudier l’influence de la concentration de initiale substrat ([S]0) …afficher plus de contenu…

Ne pas faire le zéro optique sur le blanc, une éventuelle anomalie de l’absorbance du blanc se répercute sur l'ensemble des valeurs obtenues. La coloration du pNP étant stable, la lecture optique peut se faire à tout moment.
Exploitation des résultats :
• Tracer la droite A410nm mesurée = f([pNP]) puis obtenir A410nm réelle = f([pNP]) par translation de cette droite sur l’origine. • A l’aide de la loi de Beer-Lambert, déterminer le coefficient d’extinction molaire du pNP à 410 nm.
2. Mesure de la vitesse de réaction en fonction de la concentration de …afficher plus de contenu…

Préparation des solutions de substrats
A partir de la solution à 5 mM, préparer entre 1 mL et 6 mL des solutions mères de substrat aux concentrations suivantes : 1 mM; 0,5 mM; 0,25 mM; 0,175 mM; 0,140 mM ; 0,0875 mM.
Il est nécessaire de réaliser ces dilutions en cascade afin d’éviter le pipetage de très faibles volumes. Pour cela calculer les facteurs de dilution entre chaque solution et en déduire les volumes d’eau et de solution de pNPP précédente à prélever.
Il est nécessaire d’avoir au moins 0,5 mL de chacune de ces solutions de substrat.
Prévoir avant la séance un schéma des dilutions par binôme qui sera remis à l’enseignant et entrera dans la notation
(Attention à n’utiliser que des volumes que l’on peut pipeter).
2. Préparation des milieux