3: Clonage d’un gène dans un plasmide
Le clonage moléculaire est une des bases du génie génétique. Il consiste à insérer un fragment d'ADN (dénommé insert) dans un vecteur approprié comme un plasmide par exemple (voir exp4 pour une explication sur les plasmides). Le nouveau plasmide ainsi créé sera ensuite introduit dans une cellule hôte, en générale la bactérie Escherichia coli.
Celle-ci sera alors sélectionnée et multipliée afin d’obtenir une grande quantité du plasmide d’intérêt. Cloner un gène consiste donc à l’insérer dans un plasmide. Un clone sera le transformant bactérien qui contient ce plasmide particulier. Dans ce cas on parle de clone car tous les individus de la colonie bactérienne sont génétiquement identiques.
Le clonage moléculaire est donc différent du clonage reproductif (créer un individu génétiquement identique à un autre mais d'un âge différent) ou du clonage thérapeutique
(fabriquer des tissus à partir de cellules souches pour effectuer des greffes compatibles avec le receveur).
Thèmes: clonage moléculaire, vecteurs, hôtes, digestion, ligation, transformation bactérienne, X-gal
Le clonage moléculaire nécessite des enzymes de restriction capables de couper l’ADN
(exp2), et de l’ADN ligase capable de recoller les fragments d’ADN. La ligase a été isolée pour la première fois à partir du bactériophage T4. Cette enzyme est impliquée dans la réparation et la réplication de l’ADN. Elle peut lier des fragments d’ADN ayant des bouts collants (exp2) compatibles. A plus grande concentration, cette enzyme est également capable de lier deux bouts francs d’ADN. La T4 ADN ligase fonctionne en utilisant de l’ATP et du Mg2+. Elle possède un optimum d’activité de 16°C, mais reste bien active à température ambiante.
Le premier clonage fut réalisé en 1972 par Paul Berg qui partagea le prix Nobel de chimie en 1980 avec Walter Gilbert et Frederick Sanger. En 1977, le premier gène humain, codant pour la somatostatine est cloné permettant aux