Etude du clonage dans le plasmide pBluescript de l’ADN du phage lambda.

Mots clés :

Enzyme de restriction, EcoR1, HindIII, vecteur de clonage, ADN recombinant, plasmide, pBluescript, électrophorèse, transformation, LacZ, bactérie, phage lambda.

Résumé :

L’ADN peut faire l’objet de multiples travaux. Ici notre objectif est de cloner des morceaux de l’ADN du phage lambda dans le vecteur (plasmide) pBluescript. Pour se faire nous aurons recours à différentes techniques comme la digestion enzymatique (de l’ADN du phage ainsi que du plasmide), l’électrophorèse sur gel d’agarose, la transformation (par choc thermique) pour l’introduction des plasmides dans les bactéries, la centrifugation et le pipetage. Nous allons nous demander successivement si la digestion par les enzymes de restriction est efficace, quelle est l’évolution des populations bactériennes et des différentes colonies, puis si l’insertion des fragments d’ADN est faite correctement.
Nous allons tout d’abord observer sur gel d’agarose que la digestion de l’ADN du phage s’est faite de façon partielle, nous observons plusieurs bandes, chacune correspondant à un fragment, mais moins que le nombre théorique attendu. Nous observons ensuite les colonies de bactéries dans chaque boîte de pétri dans lesquelles nous avons déposé les différents tubes de transformation. Dans la première boîte nous avons des bactéries recombinantes et un peu moins de non recombinantes, dans la deuxième beaucoup plus de bactéries recombinantes et dans la troisième un peu plus de bactéries non recombinantes que de recombinantes (résultat inattendu en théorie que nous tenterons d’expliquer). Les bactéries transformées possèdent donc soit des plasmides avec inserts, soit des plasmides vides soit des plasmides vides mutés. Le dernier résultat à observer est celui de la présence des inserts dans les bactéries. Après purification, digestion des plasmides puis migration sur gel d’agarose nous observons une bande pour le plasmide