Exctraction b-galactosidase

9055 mots 37 pages

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Université Paris 7
DEUG SNV décembre 1997
Compte rendu de TP de BC 232 (BC-022)
1ere partie
Introduction
La constante de Michaelis et la Vmax sont deux constantes qui caractérisent un couple enzyme/substrat. Le but de ces deux journées de TP serra de déterminer ces constantes et de dégager les caractéristiques et les différents aspects d'une réaction enzymatique.
Extraction de la -galactosidase à partir de la bactérie Echerichia-coli L'étude de la β-galactosidase est faite sur un extrait cellulaire qu'on prépare à partir d'une patte bactérienne.
Les bactéries sont cultives de façon habituelle, dans les boittes de Pétri, sur un milieu nutritif. Par une centrifugation à faible vitesse les bactéries sont concentrés afin d'obtenir une patte bactérienne dense.
La patte est broyé mécaniquement dans un mortier afin de rompre les cellules. Pour faciliter le broyage on ajoute de la poudre d'alumine et quelques gouttes du tampon T (dans la suite du texte: TpT).
Le mortier est d'abord refroidi et le TpT utilisé est glacé. Cette mesure est prise pour inhiber les enzymes qui sont susceptibles de se dégrader à la température de la pièce. Toute les solutions sont gardes dans la glace pendant toute l'expérience. On choisit un tampon ayant le même pH que le cytoplasme in vivo et donnant l'activité optimale; les enzymes sont sensible aux changements du pH, donc il est nécessaire de minimiser les changements de celui-ci.
Le broyât est ensuite centrifugé à 4°C pendant 10 minutes à 10
000 rpg. Les fragments les plus

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