L’hybridation moléculaire in situ :
Introduction :
L’Hybridation in situ (H.I.S) est une technique qui permet de localiser, et de mettre en évidence des séquences d’acides nucléiques spécifiques au niveau d’une coupe de tissu, d’une préparation chromosomique ou sur colonie de bactéries à l’aide de sondes. Elle a été mise au point en 1969 par GALL et PARDUE.
1)Principe général :
On associe par hybridation une sonde d’acides nucléiques (ADN ou ARN simple brin ) de séquence connue (dont l’emplacement est t connu dans le génome) complémentaire à celle des acides nucléiques que l’on cherche à localiser. L’appariement de deux séquences nucléotidiques se base sur la complémentarité des bases puriques et pyrimidiques qui s’associe en formant des liaisons H.

1) Dans un premier temps, il faut dénaturer la double hélice d’ADN, c'est-à-dire la séparer en deux simples brins. La dénaturation de la molécule d’ADN se fait lorsqu’on augmente la température, environ 94°C. A cette chaleur, les liaisons faibles (triple entre C et G et double entre A et T) qui assuraient la cohésion de la double hélice sont rompues pour donner deux simples brins.
On appelle Tm : la température de demi-dénaturation. Elle correspond à la température à laquelle 50% des hybrides sont dissociés. Tm dépend de la longueur du fragment d’ADN, de sa composition en bases, de la présence de certains ions dans le milieu.
1) Ensuite, il faut placer les molécules d’ADN dénaturées et les sondes (simple brin également) dans le même milieu pour qu’elles puissent s’hybrider, c'est-à-dire s’associer entre elles. La température doit être entre 50-60°C pour permettre l’hybridation. (variable en fonction de la longueur des séquences.)
2)
. L’hybridation sur chromosomes métaphasique
Objectif : Déterminer sur quel chromosome et dans quelle région se trouve le gène dont on possède la sonde.
Pratique : les chromosomes sont préparés en métaphase à partir de lymphocytes circulants ou d'une lignée lymphoblastoïde.