Préparation de rétrovirus MSCV concentré dans des cellules Eco-Phoenix.
Date : 02.04.2014
Culture Eco-Phoenix.
Matériel
PBS 1X sterile
DMEM (4,5g/l glucose) + 10% FCS i 407 + 1 mM PyrNa + PS
Trypsine diluée

1. Aspirer le milieu de culture et laver les cellules au PBS.
2. Ajouter 1 mL de trypsine diluée pour une T75 et incuber 5 min à 37 °C.
3. Decoller les cellules en tappant sur le bord de la boite.
4. Ajouter 9mL de milieu et rincer la surface de la boite 2-3 fois.
5. Recuperer les cellules dans un falcon et centrifuger 5 min à 1200 rpm.
6. Enlever le surnageant et resuspendre les cellules dans 5 mL, les compter et les remettre en culture.
7. Split ratio : ¼ à 1/5 tous les 2-3 jours.

Transfection
Materiel
DMEM (4,5g/l glucose) + 10% FCS i 407 + 1 mM PyrNa + PS
Chloroquine 25 mM stock solution
CaCl2 2M (ou 2,5 M)
HBS 2X
Eau stérile

Jour 0 : 18-24h avant transfection mettre 3,5 à 4M de cellules /10 cm plate dans 10 mL.
Jour 1 : Avant transfection , enlever le milieu de culture et mettre 8mL de milieu + 8 L chloroquine ( 25 M final ) sur les cellules.

Diluer l’ADN plasmidique dans l’eau dans un tube de polypropylène. Ajouter le CaCl2. Utiliser un tips de P1000 et ajouter 1mL de HBS faire buller vigoureusement et ajouter le mix au goutte à goutte sur les cellules.
8 à 10h après transfection changer le milieu pour 10 mL de milieu frais.
Jour 2 : 24h après transfection aller en P2, enlever le milieu et ajouter 6 mL de milieu frais.
Jour 3 : Collecter les surnageant de virus, les filtrer ( filtre 0,45 m) et les pooler dans un falcon. Mettre 1 mL par tube eppendorf et les centrifuger 1h à 14 000 rpm ( vitesse maximum) dans une pièce a 4 °C. Aspirer délicatement le surnageant et resuspendre le culot de virus dans 100 L de milieu ( concentré 10 X).
Congeler dans l’azote liquide les tubes et conserver à -80 °C.
Titration sur cellules 3T3

Materiel :
PBS sterile
DMEM (4,5g/l glucose) + 10% NCS + gentamicine
Polybrene stock solution (4mg/ml) trypsine diluée