Régulation eucaryote (td)

Pages: 5 (1187 mots) Publié le: 29 janvier 2013
Exercice 11 Les anticorps de classes IgA et IgM, abondamment présents dans les sécrétions externes des muqueuses intestinales, participent aux défenses immunitaires contre les agents infectieux ingérés. Le gène PIGR joue un rôle essentiel dans ce processus en assurant le transport des Ig au travers de la muqueuse intestinale. Le gène PIGR contient un élément régulateur dénommé motif E, localisé71 paires de bases en amont du site d’initiation de transcription. Cet élément est indispensable pour obtenir un niveau basal de transcription. Le motif E est reconnu par des facteurs de transcription contenant des domaines de liaison à l’ADN de type hélice-boucle-hélice et leucine zipper. Parmi ces facteurs de transcription, on trouve les protéines MYC et USF. Le gène PIGR est exprimé dans lescellules intestinales différenciées qui produisent USF et généralement réprimé dans les cellules tumorales de cancer colorectal qui sur-expriment MYC. Ces observations ont permis d'émettre l'hypothèse que les facteurs USF et MYC pourraient reconnaître l’élément E et agir de manière opposée sur l’expression de PIGR. Les expériences suivantes ont été réalisées pour tester cette hypothèse.
-A) retardsur gel (figure 1).

B) transfections (Figure 2).

Le promoteur du gène PIGR contenant le motif E est inséré dans un plasmide en amont du gène de la luciférase (plasmide WT-PIGR). Le plasmide est co-transfecté dans des cellules intestinales avec un plasmide codant les facteurs USF ou MYC. 24h après transfection, l’activité luciférase est analysée (figure 2).

-C) immuno-précipitation dechromatine (figure 3). Des cellules en culture sont traitées par la formaldéhyde (induit un pontage covalent ADN-protéines). La chromatine est alors isolée et immunoprécipitée avec des anticorps antiMYC, anti-USF ou anti-histone H4 acétylée. L’ADN est extrait de la chromatine immunoprécipitée et soumis à PCR avec des amorces spécifiques du promoteur du gène PIGR (la taille attendue est de 205 bp). Lefragment amplifié contient le motif E. Les fragments PCR sont analysés par électrophorèse

Figure 3

Piste 1 : chromatine incubée avec un anticorps contre une protéine non chromatinienne Piste 2 : chromatine immunoprécipitée par un anticorps anti histone H4 acétylée Piste 3 : chromatine immunoprécipitée par un anticorps anti USF Piste 4 : chromatine immunoprécipitée par un anticorps anti MYC2) Tirer les principales conclusions de ces expériences. Supportent-elles l’hypothèse de départ ? Que montre l’expérience réalisée avec les anticorps contre la forme acétylée de l’histone H4 ? 3) La séquence en amont du site de transcription est la suivante. Proposez un couple d’amorce qui permettrait de réaliser la PCR de la figure 3. Ne pas commenter, donner simplement la séquences etl'orientation des amorces 5’->3’)
agctagaaag gcaacgatgg gccagccagg ggctggccac cgacagaaca aggattccca aaggccaaaa ggtgcctgtg gcatcttcac agtaacagag tgaaaggaaa ggagagtggc gcttgacatt tctccccaag gcaagggatc cctttaagag ctgtccctca gtcaaaggaa tgtgagagTC cccaggtgtg tcctgaagct accaaatgga ACATGAccct ggtcaaacac

CANNTG = motif E

Exercice 12 (examen 1ère session, janvier 2010) A/ Le gène c-fos est un facteur detranscription, homologue de v-fos, un oncogène d’un rétrovirus murin. Lorsque des cellules de mammifères sont incubées en présence de milieu de culture minimum, le gène c-fos est inactivé. Lorsque des facteurs de croissance sont ajoutés au milieu de culture minimum, le taux de transcription augmente très rapidement jusqu’à 15 minutes puis les ARNm de c-fos disparaissent brusquement. Cette étape estobligatoire. La non-disparition de ces ARNm est associée à la transformation tumorale ; c’est ce qui se produit avec le gène v-fos lors de l’infection virale. La régulation de l’expression peut être donc être divisée en deux phases, une phase d’activation du gène (étudiée par l’expérience 1) et une phase d’inactivation des ARNm (étudiée par l’expérience 2).

Expérience 1/ Les 1000 paires de bases...
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