Fils d'un conseiller patrimonial et d'une galeriste, Stéphane Guillon est d'origine corse par sa grand-mère, Pauline Paoli, originaire de Fozzano3. Il est exclu de son lycée en seconde. Alors que ses parents l'ont inscrit dans une « boîte à bac » près de la gare Saint-Lazare, à Paris1, il suit une formation de comédien4, notamment les cours de théâtre de Jean-Laurent Cochet. De 17 à 35 ans, il tourne dans une dizaine de téléfilms où il ne réussit cependant pas à percer. Sa carrière d'humoriste débute en 19901 par un premier one-man-show.

En 1999 et 2000, il collabore à la chronique Fallait pas l'inviter avec Michel Muller sur Canal+, insérée à l'émission Nulle part ailleurs, animée alors par Nagui.
Stéphane Guillon en 2011 au festival du rire de Montreux.

Mais c'est en tant que chroniqueur qu'il devient connu du grand public. Il intervient en effet dans La Grosse Émission, sur Comédie !, en 2001-20025. Puis, après s'être fait remarquer sur scène dans son one-man-show Petites horreurs entre amis au festival d'Avignon en 2002 puis au Théâtre de la Main d'or de Dieudonné au printemps 20036, il rejoint Stéphane Bern à la radio dans l'équipe du Fou du roi, sur France Inter. Celui-ci lui propose de le suivre à la télévision, sur Canal+, dans son émission 20h10 pétantes, où il assure une chronique entre 2003 et 2005. Suite à l'arrêt de l'émission, il continue sur Canal+ avec Thierry Ardisson dans Salut les Terriens à partir de 2006. À partir de janvier 2008, il tient une chronique intitulée « L'humeur de... » à 7h55 du lundi au mercredi dans Le Six trente dix sur France Inter. Après un certain nombre de polémiques, cette chronique est supprimée par Jean-Luc Hees à l'été 20107.

Il continue à mener en parallèle sa carrière d'humoriste sur scène, avec Liberté (très) Surveillée, son dernier spectacle en date, ainsi que d'acteur au cinéma.

Le 6 décembre 2010, jour de ses 47 ans, il est le maître de cérémonie de la soirée de clôture du festival de comédie de