Ezio devenu depuis un maître assassin. L'action se déroule notamment à Rome durant la Renaissance, ville qui apparait brièvement dans la dernière mission du jeu de l'épisode précédent3, et en Espagne en 1507.
Ce qui suit dévoile des moments clés de l’intrigue :
L'histoire reprend pour Ezio en 1499, juste après avoir vu Minerve, dans les sous-sols du Vatican. Il fuit la ville avec son oncle Mario, avec la Pomme d'Eden.
En janvier 1500, ils rejoignent leur résidence de Monteriggioni, sereins. Ezio s'apprête à prendre du repos et raconte donc ce qu'il a vu à Rome à Mario, sa mère Maria, sa sœur Claudia, Machiavel et Catherine Sforza, avec qui il passe la nuit. Le lendemain, la ville est prise d'assaut par les forces de César Borgia, qui tue Mario et vole la Pomme. Ezio tente de défendre la ville le temps que les habitants fuient, mais il est blessé. Malgré cela, il part rejoindre Machiavel à Rome, mais s'effondre de son cheval.
C'est là que Desmond émerge de l'Animus. Il découvre que Lucy, Shaun et Rebecca l'ont emmené à Monteriggioni. Desmond et Lucy utilisent leurs compétences d'assassins pour rouvrir le passage vers la crypte de la résidence Auditore, seul lieu suffisamment sûr en Italie pour s'y réfugier. Une fois fait, Desmond replonge dans l'Animus, pour retrouver Ezio, sauvé par un mystérieux homme et amené à Rome. Il rejoint Machiavel, qui lui explique dans quelle situation se trouve la cité, totalement sous le contrôle des Borgia. Il enfile à nouveau sa tenue d'Assassin pour affronter les forces armées de César.
Avec l'aide de ses alliés Assassins, venus à Rome pour combattre, Ezio forme une armée de résistants au régime militaire des Borgia, en les initiant aux rites des Assassins. Il retrouve également Leonard de Vinci, contraint par Cesare de construire des armes modernes qu'Ezio doit détruire pour affaiblir l'influence des Borgia et permettre la reconstruction de la