TP Biologie Moleculaire (Biol 347)
Rapport Final De TP realisé par: •Ramy Meouchy 60952 •Amer Choueib 61122

Première Séance: Extraction de l’ADN plasmidique
Bactéries Utilisées : E.Coli dans unmilieu de culture LB (boite de pétri contenant des bactéries ayant déjà subit la transformation). Les différentes étapes de l’expérience : a) Lyse des cellules bactériennes. b) Déproteinisation c)Enlèvement de L’ARN: traitement Rnase d) Précipitation de l’ADN
But : ADN une fois extracté, on peut l’amplifier (PCR) , le doser , le séquencer ou le cloner...

La démarche de l’éxpérience:
Onfait une mini-préparation Classique . C’est une méthode de lyse alcaline. • Prendre de la culture bactérienne (déjà préparée) 2 à 5 ml et centrifuguer ,a une vitesse de 5000/7000 Rpm, une durée de 2 à 5mn. • Résultat : Culot + surnageant • Rejetter le surnageant dans L’eau De Javel (EDJ) goutte à goutte ou l’aide d’une micropipette.

Reprendre le culot de bactérie . • Ajouter 100 ul de lasolution 1 (TEG) • Rôles des composantes de cette solution nommé TEG : T pour TETRIS : c’est le tampon dont le role est de tamponner le PH E pour EDTA : protection contre les DNases G pour glucose : dont lerole est d’équilibrer la pression osmotique. • Ajouter 200 ul de la solution 2

• Roles des composantes de la solution 2 cotenant : a) NaOH dont le role est de dénaturer l’ADN b) SDS qui est undétergent qui joue le role de la lyse des cellules bactériennes. IL déstabilise les bicouches lipidiques de la membranes des cellules et dénature les protéines surtout celles liées à la chromatine. • Bienagiter (ne pas wortexer ). Attendre 5mn tube sur la paillasse à la température ambiante. Le contenu devient collant .

• Ajouter 150 μl de la solution 3 . Bien agiter (wortexer).

solutionTrouble

Solution 3

• La solution 3 est AcK (acétate de potassium) qui a un role neutralisant pour l’ADN plasmidique. • Laisser dans la glace 5 à 10mn.

• Centrifuger 10 mn (1000 Rpm ; 2 fois)