ETUDE CINETIQUE DE LA TRYPSINE I.BUT : Le but de ce TP est de déterminer les paramètres cinétiques de la Trypsine. Tout d’abord, en étudiant la vitesse de la réaction au cours du temps puis en étudiant l’influence de la concentration d’enzyme et de substrat sur la cinétique enzymatique de la Trypsine. II.PRINCIPE : La trypsine est une enzyme digestive du suc pancréatique qui a pour but de digérer les protéines. C’est une endonucléase qui hydrolyse les liaisons peptidiques dans lesquelles un acide aminé basique (lysine, arginine) engage sa fonction acide. Son activité enzymatique et son mécanisme d’action peuvent être étudiés à l’aide des substrats synthétiques comme le benzyloxycarbonylarginyl-para-nitroanilide.
Réaction d’hydrolyse du substrat par la Trypsine : Le produit libéré (la p-nitroaniline) après la réaction enzymatique va pouvoir être dosé par spectrophotométrie à 410 nm. D’après le spectre d’absorption, le pic d’absorbance du produit est à 380 nm. Cependant, à cette longueur d’onde le substrat est toujours en présence dans le milieu alors que nous désirons doser le produit. On prend donc une valeur d’absorbance (410 nm) pour laquelle il n’y a plus de substrat dans le milieu. Définitions : * Enzyme : Il s’agit généralement de protéines. Une enzyme est un catalyseur spécifique. Elle accélère la réaction. Plus spécifiquement, la Trypsine est une enzyme catalysant l’hydrolyse des liaisons peptidiques au niveau de la lysine et de l’arginine. * Vitesse initiale (v) : La vitesse initiale correspond à la vitesse de réaction lorsque le système contient uniquement du substrat et ne contient pas de produit. C’est la tangente d[P]/dt à la courbe [P] = f(t) au point t=0. * Vitesse maximale (Vm) : Vitesse initiale maximale théorique que pourrait atteindre l’enzyme si elle était totalement saturée par son