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Hplc

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TP de BSF1 :
DETERMINATION DU SITE ACTIF D’UN PEPTIDE SYNTHETIQUE PAR HPLC

Année 2011/2012

BUT :
Le but de ce TP est de déterminer la localisation, dans un peptide, du site d’interaction avec un glycosaminoglycane naturel : l’Héparine. Pour cela, on utilisera une méthode d’analyse et de purification : la chromatographie en phase inversée avec appariement d’ions en HPLC.

PRINCIPE : * Chromatographie en phase inversée avec appariement d’ions :
Dans la chromatographie en phase inversée, c’est la phase stationnaire, constituée souvent d’un hydrocarbure, qui est apolaire
La phase mobile est un solvant polaire, tel l'eau, le méthanol, ou le cyanure de méthyle (acétronitrile), ce dernier étant utilisé dans notre cas.
Un composé y est donc retenu d’autant plus que sa polarité est faible.
Chromatographie avec appariement d’ions :
Le principe est d’ajouter à l’éluant un ion compensateur qui, en présence des ions de l’échantillon, se lie à eux pour former une paire d’ions globalement neutre, succeptible d’être chromatagrafiée comme dans notre cas par chromatographie en phase inversée.
Dans notre cas, l’ion compensateur est l’acide triofluoroacétique (TFA) ; acide ayant à la fois la fonctionnalité d’être une molécule chargée négativement et de molécules hydrophobe.

* HPLC (« Hight Performance Liquid Chromatography ») :
Le principe de l’ HPLC est de séparer des particules plus fines exigeant des pressions de la phase mobile beaucoup plus élevées.

Schéma :

Schéma succinct du système :

Protocoles :
Quatre injections seront fait au cours de ce TP : * Injection « blanc » * Injection de peptide non digéré * Injection de peptide digéré * Injection du peptide digéré sur Héparine- Sépharose.

Résultats et interprétations : Conditions opératoires de l’HPLC : * Colonne :
Une colonne est un tube construit dans un matériau le plus possible inerte aux produits chimiques, souvent en inox ou en verre ;
Phase stationnaire

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