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Le clonage directionnel

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Badji Fatou Mbaye
Rugen Nicolai
L3 BBCP
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Le clonage directionnel
I-Introduction
Le clonage est une technique de biologie moléculaire qui Le clonage consiste à insérer un segment d'ADN étranger dans une petite molécule capable de se répliquer de façon autonome. Ce type de molécule d'ADN est appelé un vecteur de clonage.

Un vecteur de clonage courant est le plasmide bactérien.
Il existe 2 types de clonage :le clonage directionnel qui consiste à insérer le fragment dans un sens et le clonage non orienté qui consiste a inséré dans le fragment dans les 2 sesns.
II -En pratique :
2 . Amplification in vitro du gène à cloné par PCR:
Dans un tube Eppendorf :sont ajoutés:de l'eau ultra pure stérile,une matrice d'ADN du gène,une amorce sens et une amorce anti sens toutes, le MgCl2, le tampon d'amplification,des dNTP .le tube est mélangé et maintenu au froid avant l'introduction de la Go Taq DNA Polymerase .Le tube est inséré dans l'appareil à PCR préalablemnt programmer pour une durée de 3 heures pour 30cycles de la façon suivante : -dénaturation 92°C 30S, -hybridation 56°C 1min , -élongation 72°C 1min.
3.Digestion enzymatique de L'ADN du plasmide et au fragment d'ADN étranger coupé par la même enzyme de restriction ou une enzyme qui donne des extrémités compatibles. 2. Purification et extraction de l’ADN
Deux techniques sont utilisés pour extraire te purifier le produit de PCR et le plasmide.
L'ADN sera déposé sur le gel d'agarose à 1% et extrait par freeze-queeze (congélation dans l'azot e liquide puis centrifugation durant 15min à 10000g,L'ADN et ensuite purifié et extrait par une solution phénol/chloroforme/alcool isoamylique aprés centrifugation pendant 10min puis 5 min à 10000g et à 4°C.Deux volume d'éthanol seront ajoutés par volume d'échantillon pour précipitrer l'ADN en présence d'acétate de sodium 3M pH 5.

3. Ligature:
Le produit de PCR est ensuite ligature dans le plasmide en présence

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