Purification prothrombine

2193 mots 9 pages
I. Introduction :

La prothrombine, ou facteurII, est une chaine polypeptidique synthétisé dans le foie et intervenant dans le processus de la coagulation sanguine. Cette prothrombine est ensuite clivée en thrombine, ou facteur IIactivé (IIa), par le facteur Stuart activé ( Xa ) .
La thrombine est une glycoprotéine de la famille des sérine-protéases . Cette enzyme protéolytique bicaténaire est l'élément central du système de coagulation du sang.
La thrombine va alors permettre de transformer le fibrinogène en fibrine, d'activer les plaquettes par les récepteurs PAR et donc de permettre au sang de se coaguler.
Cette transformation de la prothrombine en thrombine peut aussi se faire grâce à un poison:

l'écarine, qui une fois injecté dans le sang va clivée le facteur II en facteur IIa et provoquer une importante thrombose.
Dans ce TP nous allons donc chercher à isoler (purifier) la prothrombine de deux manières différentes : par précipitation au BaCl2 et par chromatographie échangeuse d'ion . Nous allons ensuite essayer de déterminer l'activité enzymatique de la prothrombine transformé en thrombine, sous l'action de l'écarine et grâce à un substrat chromogénique.

II. Matériel et méthodes :

'' précipitations au Chlorure de Baryum (BaCl2) : ces précipitations consistent à isoler du reste du plasma les protéines de prothrombine grâce à des centrifugation successives et à l'ajout de BaCl2 . Chaque protéine est plus ou moins soluble en solution selon sa composition, on peut donc les séparer en fonction de leur tendance à précipiter plus ou moins vite quand on augmente la force ionique de la solution qui les contient. Après chaque ajout de BaCl2 et centrifugation une partie du surnageant sera prélevé ( S1 , S2) et le culot sera resuspendu dans une solution saline avant d'être réprécipité à nouveau ( C1 , C2 ).

'' chromatographie échangeuse d'ions : cette étape consiste à fixer sur une colonne DEAE-Sephadex échangeuse d'ion les protéines;

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