Protocole de recherche d’inserts méta génomiques présentant des effets sur la croissance de cellules HT-29 (cellules épithéliales humaines de cancer de colon)

I- préparation des lysats bactériens

I-1. Principe Ce mode opératoire permet de préparer des filtrats comprenant le milieu de culture des bactéries cassées et des fractions membranaires. Ce protocole est adapté à un méta génome utilisant E.coli comme réceptrice et un fosmide exprimant la résistance au chloramphénicol. Il est appliqué sur des clones conservés à -80°C en plaques 96 puits.. I-2. Protocole - Réaliser 4 pré cultures de chaque plaque initiale dans 150 ml de milieu 2YT en présence de chloramphénicol 12mg/ml.
NB. La pré culture s’avère nécessaire pour obtenir des filtrats à effets reproductibles sur cellules eucaryotes. -Incuber 8 heures à 37°C - Repiquer en microplaques dans les mêmes conditions - Incuber 16h à 37°C - Ajouter 50 ml d’une suspension de billes de verre 106 microns (1 g/ml dans 2YT chloramphénicol) prélevée dans une augette sous agitation - Broyer 2 fois pendant 1.50 min, 15 hertz - Filtrer 2 plaques sur une même plaque Multibrin (0.22mm en PVDF) par centrifugation (1500xg, 10 min)
NB. Pooler les filtrats 2à 2 permet d’augmenter la reproductibilité du test de criblage - Conserver les filtrats à -80°C

II. Protocole de criblage d’effet sur la croissance des cellules eucaryotes

II-1. Principe Ce criblage est conçu de manière à tester un grand nombre de clones sur microplaques 96 puits. Il a été mis au point sur cellules CV1 (cellules de type épithéloïde de rein de singe vert)en milieu dépourvu de sérum permettant à priori, une meilleure sensibilité aux filtrats. Par la suite la recherche de filtrats a été entreprise et validée sur les deux lignées cellulaires HT-29

II-2. Protocole II-2.1. Repérage des filtrats sur la croissance des cellules

II-2.1.a. Mise en présence filtrats/cellules eucaryotes - Décongeler les filtrats et