Techniques moléculaires appliquées au diagnostic microbiologique en milieu hydrique

1.Qu’est ce que la PCR
PCR est une synthèse in vitro et d’une manière exponentielle, d’une séquences ADN cible. Elle a été inventée en 1983 par le Dr. Kary Mullis. Invention pour laquelle il reçut le prix Nobel de chimie en 1993.

On l’a appelé POLYMERASE car l’unique enzyme utilisée dans cette réaction est une DNA polymérase. On l’a appelé CHAIN, car le produit d’une première réaction devient substrat de la deuxième réaction, et ainsi de suite.

C’est une technique très puissante et simple qui est rapidement devenue l’une des techniques les plus utilisées en biologie moléculaire. Cette technique amplifie un fragment spécifique d’ADN à partir d’infime quantité d’ADN source, même si l’ADN source est d’une qualité relativement mauvaise.

2.Les composantes d’une réaction PCR
ADN source: elle contient la séquence à amplifier (séquence cible) Une paire d’amorces (primers): 2 Oligonucléotides qui délimitent la séquence à amplifier dNTPs: désoxyribonucléotides triphosphate, les unités constitutives de l’ADN. Ils sont au nombre de quatre: Cytosine, Guanine, Adénine et Thiamine triphosphate. ADN polymérase thermostable: Elle catalyse la réaction d’extension des amorces fixées sur la séquence cible. Ion Magnésium (Mg2+): Un cofacteur de l’ADN polymérase. Solution Tampon: Maintient un pH et une force ionique adéquate pour le fonctionnement de l’enzyme.

Exemple type d’un mélange réactionnel de volume final de 25 μl

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COMPOSANTES 1. 10x Tampon PCR 2. dNTPs (chaque nucléotide à 25 mM) 3. Les deux amorces (25 pmoles/µL chacun) 4. ADN polymérase 5. ADN matrice (100 ng/µL) 6. Eau ultra-pure stérile (pH 7.0) VOLUME 2.5µL 0.2µL 0.4µL 0.2µL 1.0µL 20.7µL CONCENTRATION FINALE 1x 200 µM (chaque nucléotide) 0.4 µM (chaque primer) 1 Unité/25 µL 100 ng/25 µL -

tube PCR sterile

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Etapes Prédénaturation Dénaturation Appariement Extension Extension finale

Programme PCR