Gentiane jaune

TP3 : Antibiogramme a) Identification du gram de la bactérie b) But et principe Préparer sur lamelle une coloration des Grams à l’aide de plusieurs solution : du violet de gentiane, du lugol, de l’éthanol à 70% et de la fuchsine de ziehl. Cette manipulation a pour but de révéler le type de gram de l’échantillon à tester et de savoir si ces souches sont des bacilles ou des coccis grâce à une observation au microscope. c) Résultats Le test de coloration de Gram révèle une coloration rose. J’en

types de bactéries présentes dans le yaourt, les lactobacilles et les streptocoques. On veut trouver, s’ils sont à Gram positif, ou négatif. 2) Matériel Matériel biologique - yaourt Matériel chimique - alcool (95%) - violet de gentiane - Lugol - Fuchsine - Eau distillée - Huile d’immersion Matériel physique - Lame/lamelle - Ensemenseur - Cristallisoir - 2 bâtonnets en verre - bec Bunsen - microscope - pipette 3) Déroulement de l’expérience D’abord, on a préparé

platine. • Etuve à 28° C. • Bec Bunsen • Microscope • Lames Produits utilisé : • Ethanol à 95%. • Solution d’hypochlorite de Calcium à 5 %. • solution de Fushine. • Eau distillée stérile. • Violet de Gentiane. • Lugol • Huile d’immersion. Mode opératoire : ➢ Isolement des bactéries : -Stériliser les nodules par l’éthanol à 95% pendant 3à 10seconde . - Transférer les nodules dans du calcium hypochlorite à 5% pendant 3 minutes. - Rincer

les bactéries et de les distinguer à l'examen (le violet de gentiane (Gram +) ou la fuschine (couleur rose) (Gram -). Son avantage est de donner une information rapide sur les bactéries présentes dans un produit ou un milieu tant sur le type que sur la forme. Mode opératoire : * Réaliser un frottis  * Fixer la préparation à la flamme, puis laisser refroidir la lame. * Immerger les lames dans la solution de Violet de Gentiane pendant 1mm. * Immerger les lames dans du Lugol (2 fois

que celles à Gram positives. De plus, cette paroi est très riche en lipides (membrane externe de la paroi) dans laquelle l’éthanol est fortement soluble… B- Technique - Réaliser un frottis et le fixer. - Coloration : violet de gentiane phéniqué durant une minute. Toutes les bactéries prennent ce colorant et sont donc colorées en violet. - rincer à l’eau du robinet - Mordançage : recouvrir la lame de réactif de Lugol 1 minute (réactif iodo-ioduré qui accentue la coloration)

Coloration de Gram et observation au microscope de différentes bactéries But de la manipulation: Le but est d'apprendre à réaliser un frottis pour prélever des bactéries dans leur milieu afin de pouvoir les observer au microscope. Le but est également d'apprendre à réaliser des colorations afin de déterminer si les bactéries possèdent une paroi Gram + ou Gram -. Mode opératoire du frottis (excepté pour la préparation du 4 mars): -Travail en milieu stérile (autour de la flamme bleue

arrondies…) ; - la taille ; - le mode de regroupement ; - l’homogénéité de la forme et de la couleur. Mode opératoire : • réaliser un frottis et le fixer (voir fiche technique n°4) ; • plonger la lame dans le violet de gentiane (ou cristal violet) pendant 1 minute ; • plonger la lame dans une solution de lugol pendant 1 minute ; • rincer à l’eau distillée les deux faces de la lame ; • décolorer dix secondes à l’alcool (face vierge d’abord puis frottis) ;

membrane externe supplémentaire. L’observation se fait au microscope optique à l’objectif x100 avec de l’huile à immersion. Principe des réactions biochimiques Le violet de gentiane traverse la paroi et les membranes des bactéries puis colore le cytoplasme. Le Lugol provoque une combinaison chimique entre le violet de gentiane et les composants cytoplasmiques des bactéries et fixe ainsi la coloration dans le cytoplasme. L’alcool traverse uniquement la paroi des bactéries gram – et décolore le cytoplasme

Réalisation du frottis à partir d’un milieu solide (Gélose) 1 : avec puis 2 : Passer la lame à la du côté où vous déposer votre échantillon. 3 : 1 goutte sur votre (avec la tige métal), rempli à 100 ml d’ Passer un sous la et laisser refroidir Pointer une colonie isolée et ne faites que toucher à celle-ci. Votre contiendrea suffisament de bactéries même si vous ne les voyez pas (Ø en mettre trop) Émulsionner l’inoculum(culture)

contraste de quantité 7• le contraste simultané 1• le contraste de couleur en soi C’est le plus simple des sept contrastes car pour le représenter il est possible d’utiliser n’importe quelle couleur pure et lumineuse Le jaune le rouge et le bleu ou le magenta / jaune /cyan sont les expressions les plus fortes du contraste de couleur en soi, toute les couleurs pures non mélangées peuvent créer ce contraste. Les couleurs se distinguent bien les unes par rapport aux autres. Plus on va vers