Ligand

CHIMIE/ Pr. M. SAFI/ HPLC-08 5) La chromatographie d'affinité La chromatographie d'affinité consiste à greffer, sur un support solide inerte, un ligand présentant une interaction ligand-molécule conduit à une fixation ou une rétention de cette dernière. L'élution est ensuite effectuée au moyen d'un solvant qui favorise la dissociation du complexe ligand-macromolécule. Cette technique est surtout utilisée en biologie dans le cas de la purification des protéines, dans des processus de séparation

tridimensionnelle des protéines est-elle possible ? Flexibilité conformationnelle des protéines Liaisons et interactions des protéines Liaison d’un ligand sur un seul site 7 8 14 18 20 22 22 24 24 26 26 27 IV Table des matières Liaison coopérative d’un même ligand sur des sites multiples semblables : interactions homotropiques Liaison de plusieurs ligands sur des sites différents : interactions hétérotropiques Concept d’allostérie Modèle concerté Modèle séquentiel Les protéines sont-elles des

en peptides antigéniques, apprêtassions et présentation sur les molécules de CMH II aux LT cd4+ th0 (CPA professionnelle). - activation des LT : (par les LB et les CPA) + activation LB  Synthèse de molécules de surface : CD40L+++ et CD30L (ligands réceptifs sur le LB : CD4 et CD30) , B7-1 ou B7-2 (CD28).  synthèse d’IL2 et son Rcp : facteur de croissance autocrine induisant une expansion clonale des LTcd4+ qui sous l’effet d’un microenvironnement favorable (IL4) subissent une différenciation

immunitaire. Les organes et tissus lymphoïdes sont disséminés dans l'organisme, les cellules circulent dans ces organes et entre ces organes via le sang et la lymphe. Les cellules communiquent entre elles soit par contact direct (notion de récepteur-ligand) soit à distance par le biais de molécules sécrétées (notion de récepteur-médiateur). Ces molécules sécrétées, solubles, sont appelées les cytokines. Ce terme générique regroupe des lymphokines, des monokines, des chimiokines. On parle aussi pour

molécule qui agit sur la vitesse de la réaction enzymatique : soit il l’accélère (on dit alors que c’est un activateur de la réaction), soit il la ralenti (et on parle alors d’inhibiteur de la réaction). Un ligand est toute molécule qui se fixe sur l’enzyme (le substrat ou l’effecteur sont des ligands). Le schéma réactionnel est le schéma qui rend compte des évènements depuis le moment où on mélange l’enzyme et le substrat jusqu’au moment où le produit apparait. E + S ES → E + P Le complexe

Liquide Liquide Liquide Liquide Différence de solubilité entre les deux phases Différence de solubilité entre les deux phases Interactions ioniques avec la phase solide Interactions spécifiques avec le ligand Elution selon la taille Echange d’ions Groupements ionisables Affinité Exclusion diffusion Ligands spécifiques Billes poreuses 11 Chromatographie Liquide Haute Pression HPLC Séparation d’acides gras par HPLC Injection à la seringue Vanne d’injection Robinet Temps (min) solvant

/base forte par conductimétrie. I.3 Réactions de complexation On introduira la nomenclature des complexes au fur et à mesure des besoins. Couple donneur-accepteur de ligand. Constante d’équilibre de la réaction de dissociation : M Ln M n+ + nL− Sur des exemples on traitera la compétition entre deux ligands ou entre deux centres métalliques. Constante de formation. Domaines de prédominance du complexe et de l’ion libre en fonction de pL. Constante de formation globale. I.4

d’origine (ne pas transvaser ni déconditionner). Ne pas compléter un flacon ouvert. Si dilution nécessaire: extemporanée, avec de l’eau ou du sérum physiologique stérile, dans un contenant stérile et ne doit pas être conservée. Comprendre le concept ligand-récepteur Les récepteurs sont à l’origine : des effets de la plupart des médicaments de la relation entre la concentration de médicament et l’effet (= pharmacodynamie) de la sélectivité des médicaments « Clef et serrure » Expliquer le rôle

utilisé par les molécules insolubles dans les lipides (glucose, fructose, galactose) Adapted from P.L. Toutain, INRA Diffusion facilitée par un uniport modèle Ping Pong • La protéine de transport (uniport) en se transconformant sous l’action du ligand assure le rôle d’une navette entre les deux faces d’une membrane; elle crée un passage hydrophile dans la zone hydrophobe de la membrane Transport lent mais prolongé • • Adapted from P.L. Toutain, INRA DIFFUSION PASSIVE ET DIFFUSION

notre étude à l’aide d’une étude ligand récepteur en utilisant un protocole proche d’un test ELISA. Pour connaître sur quel effecteur à quelle affinité pour telle enzyme de la chaîne respiratoire. D ‘autres méthodes sont certainement possible mais notre manque de connaissances et surtout de pratique nous limites sur les autres protocoles possibles. Un double immunomarquage in situ aurait-il une résolution suffisante pour étudier précisément les interaction complexe ligand ? D’un point de vue protocolaire